张丹萍　黎纯　韩建林

摘 要：【目的】旨在利用分子标记筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡，为后期组建纯系绿壳蛋旧院黑鸡核心群奠定基础。【方法】通过在1 000只旧院黑鸡群体中，应用EAV-HP和ALV的插入整合开展DNA分子标记筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡，通过PCR检测和分析EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体中的分布情况，研究绿壳蛋和隐性白羽在旧院黑鸡群体中的基因型频率和基因频率。【结果】在旧院黑鸡群体中检测到了大量的EAV-HP的插入整合，但只存在少量的绿壳蛋纯合子（基因型为LC/LC）个体，占旧院黑鸡群体的15.7%;检测到了少量的ALV的插入整合，无纯合子，只有18个（基因型为N/C、C/C）隐性白羽杂合子，占到整个群体的1.93%。【结论】应用DNA分子标记辅助育种技术，获得了无隐性白羽的纯系绿壳蛋鸡，绿壳蛋率 100%。

关键词：旧院黑鸡;分子标记;EAV-HP;ALV

中图分类号：S831.2 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2022）04-0035-06

旧院黑鸡是四川省万源市特有的地方品种，其最显著的特征为乌皮、黑羽、五豆冠、黑胫[1]。旧院黑鸡散养历史较长，受到混养外来品种的杂交影响，发生了遗传漂移，品种退化严重[2]。建立的原种场由于保种资金投入不足，仅起到了机械性的保护作用，保种力度不够，也没有真正去挖掘旧院黑鸡品种本身存在的优良价值和特色性状基因，对黑羽、乌皮乌肉、绿壳蛋的特异遗传基因的挖掘和提纯工作还处在起步阶段。目前，国际上“生物物种资源主权”争夺愈演愈烈，依法保种刻不容缓，保种的目的不光是保存，而是充分有效的利用，利用是最好的保护[3]。中央全面深化改革委员会第二十次会议通过《种业振兴行动方案》，会议强调农业现代化，种子是基础，必须把民族种业搞上去，把种源安全提升到关系国家安全的战略高度，集中力量破难题、补短板、强优势、控风险，实现种业科技自立自强、种源自主可控。自2021年起，在全国范围内组织开展农业种质资源普查，摸清我国农作物、畜禽和水产种质资源家底。四川省“十三五”农作物及畜禽育种攻关实施方案中将种质与基因资源的收集、保存、创制、鉴定和畜禽水产新品种（配套系）选育纳入攻关任务。因此本项目由达州市畜牧技术推广站牵头，国际家畜研究所（LIRI）、铜仁学院共同参与研究，通过基因组标记挖掘和保护原产地旧院黑鸡优异遗传资源，其自然群体中，约有5%的个体产绿壳蛋[4]，我们前期和国际家畜研究所（ILRI）以及中国农业科学院北京畜牧兽医研究所（IASCAAS）通过对部分旧院黑鸡群体以及其它4个绿壳蛋鸡群体的研究，即5个绿壳蛋鸡群体中EAV-HP在SLCO1B3基因5′-非编码区插入整合频率和类型的研究中发现，经过初步选育的旧院黑鸡群体中携带较高频率的EAV-HP整合，EAV-HP以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5-非编码区，从而启动了SLCO1B3基因在卵壳腺中的特异性表达，运输胆绿素沉积在蛋壳上，完全符合绿壳蛋形成的分子遗传学机制，导致鸡产绿壳蛋，如图1;但其中也存在少数携带ALV整合的杂合子个体，ALV插入整合在TYR基因的第4内含子中，导致TYR基因的转录产物的异常表达，从而形成隐性白羽性状[5]，如图2;但由于杂合子个体无法从表型进行判断基因型，利用双重PCR方法检测不同群体中EAV-HP和ALV的整合情况，可以全部筛选出绿壳蛋鸡群中少量存在的隐性白羽杂合子个体，实现快速检测、筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡，可根据PCR检测结果鉴定组群、选种选配、补饲培育，及时分析选育效果，不断改进选育方法，为后期培育特色、优质、节粮、高产型新品种和配套系奠定基础，实现了分子标记辅助育种应用。

1 材料与方法

1.1 试验对象

选取来自四川省省级遗传资源保种场、四川省省级畜禽核心育种场和旧院黑鸡原种场——万源恒康农业有限公司旧院黑鸡，通过科学筛选1 000只（母鸡900只，公鸡100只），在相同条件下饲养;参考《鸡饲养标准》（NY/T33-2004）并结合生产实际情况饲养，自由饮水和采食[6]。

1.2 方法

1.2.1 血液中总DNA的提取 选取四川省万源市原产地原种场4月龄旧院黑鸡1 000只，其中母鸡900只，公鸡100只。用真空采血管进行翅下采血，-20 ℃ 冷冻后加干冰邮寄国际家畜研究所北京办事处和铜仁学院，解冻后采用全血基因组DNA快速提取试剂盒（红细胞裂解液、细胞核裂解液、蛋白沉淀液和DNA溶解液组成）提取DNA，然后溶于TE中。将已提取的DNA样品用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图3。

检测结果显示：泳道中的DNA样品带型清晰、整齐，无明显的拖尾现象，说明提取的DNA完整性好，无明显降解，可以作为模板DNA进行PCR扩增。提取的基因组DNA全部用ND-10001紫外分光光度計检测其浓度和纯度，结果显示每个样品的OD_260/280值均在1.8～2.0，表明基因型DNA的纯度良好。根据检测的浓度，取部分样品DNA原液并稀释到约50～100 ng/μL用于工作基因组DNA，剩余的DNA原液置于-20 ℃保存[1]。

1.2.2 PCR检测EAV-HP在旧院黑鸡群体中的分布 应用“5个绿壳蛋鸡群体中EAV-HP在SLCO1B3基因5-非编码区插入整合频率和类型的研究” [5]文章中所公布的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

采用PCR方法，检测旧院黑鸡基因组DNA是否有EAV-HP的插入整合。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的条带类型，预期扩增出目的片段长度为364  bp和/或约190  bp，与分子量Marker I比较，扩增产物大小与目的长度一致且特异性好[1]，电泳结果见图4。

1.2.3 PCR检测ALV在旧院黑鸡群体中的分布 应用“两种内源性逆转录病毒在不同原鸡和家鸡基因组中插入整合分布的研究”[1]文章中所公布的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

采用双重PCR检测旧院黑鸡群体的基因组DNA，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的条带类型，扩增出目的片段长度为481 bp和/或345 bp，与分子量Marker I比较，扩增产物大小与目的长度一致且特异性好，电泳结果见图5。

2 结果与分析

2.1 EAV-HP在旧院黑鸡群体中的分布

试验结果显示：①在1 000只旧院黑雞群体中有43个（其中公鸡9个，母鸡34个）未扩增到分子标记片段，无法完成后期的DNA分子标记筛选;②在剩余的957个旧院黑鸡群体中（母鸡866只，公鸡91只）检测到了870个（基因型为LC /N、LC/LC）EAV-HP插入整合，占到整个群体的90.91%;其中866只母鸡检测到787个（基因型为LC /N、LC/LC）个体，占母鸡群体的90.88%;91只公鸡检测到83个（基因型为LC /N、LC/LC）个体，占公鸡群体的91.21%;③在957个旧院黑鸡群体中有725个绿壳蛋杂合子（基因型为LC /N），占群体的75.76%;其中866只母鸡中有651个绿壳蛋杂合子（基因型为LC /N）个体，占母鸡群体的75.17%;91只公鸡中74个绿壳蛋杂合子（基因型为LC /N）个体，占公鸡鸡群体的81.32%;④同时还发现存在少量的纯合子（基因型为LC/LC）个体，957只旧院黑鸡群体中有145个纯合子（基因型为LC/LC），占群体的15.15%;其中866只母鸡中有136个绿壳蛋纯合子（基因型为LC/LC）个体，占母鸡群体的15.70%;91只公鸡中9个绿壳蛋纯合子（基因型为LC/LC）个体，占公鸡群体的9.89%;⑤还有87个（基因型为N/N）个体未检测到EAV-HP插入整合，占到整个群体的9.09%;其中866只母鸡中有80个个体（基因型为N/N），占母鸡群体的9.24%;91只公鸡有7个（基因型为N/N）个体，占公鸡鸡群体的7.69%。EAV-HP在旧院黑鸡群体中的基因型频率和绿壳蛋基因频率见表3。

2.2 ALV在旧院黑鸡群体中的分布

结果显示：①在1 000只旧院黑鸡群体中有68个（其中公鸡7个，母鸡61个）未扩增到分子标记片段，无法完成后期的DNA分子标记筛选;②在剩余的932个旧院黑鸡群体中检测到了18个（基因型为N/C、C/C）ALV插入整合在TYR基因第4内含子中，占到整个群体的1.93%;其中839只母鸡中有17个杂合子个体（基因型为N/C），占母鸡群体的2.02%;93只公鸡中有1个杂合子个体（基因型为N/C），占公鸡群体的1.08%;纯合子个体（基因型为C/C）均没有被检测到;③932个旧院黑鸡群体中，有914个（基因型为N/N）个体未检测到ALV插入整合，占到整个群体的98.07%;其中839只母鸡中有822个（基因型为N/N），占母鸡群体的97.97%;93只公鸡中92个（基因型为N/N）个体，占公鸡鸡群体的98.92%。ALV在旧院黑鸡群体中的基因型频率和基因频率结果见表4。

3 讨论

本研究采用分子标记辅助选择技术，开展旧院黑鸡群体中EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布的情况的研究，发现了大量的EAV-HP和少量ALV特色性状基因片段的插入整合，EAV-HP以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5-非编码区，从而启动了SLCO1B3基因在卵壳腺中的特异性表达，运输胆绿素沉积在蛋壳上，完全符合绿壳蛋形成的分子遗传学机制，导致鸡产绿壳蛋;ALV插入整合在TYR基因的第4内含子中，导致TYR基因的转录产物的异常表达，从而形成隐形白羽性状[7]。 有研究表明，但自然群体中，约5%的鸡能够生产蓝壳蛋[8]， 旧院黑鸡绿壳蛋的蛋壳强度极显著高于褐壳蛋和白壳蛋[9-10]，且旧院黑鸡绿壳蛋对白壳蛋呈显性遗传[11-12]。通过特定DNA分子标记筛选技术，剔除隐性白羽杂合子个体，筛选出的旧院黑鸡实验群体产绿壳蛋率达到100%，实现了旧院黑鸡绿壳蛋率从5%到100%的飞跃，完成了运用DNA分子标记快速检测、筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡，为后期培育纯系绿壳蛋旧院黑鸡新品种奠定基础。

4 结论

分子标记辅助选择育种技术可以有效快速地选择有利基因，提高选种的准确性和可靠性，缩短育种时间，扩大群体规模，因此备受关注，本项目应用分子标记筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡，获得了无隐性白羽的纯系绿壳蛋鸡，绿壳蛋率达100%，为后期组建旧院黑鸡纯系绿壳蛋核心群奠定基础。

参考文献：

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[4] 徐恢仲，单天锡，许由，等.旧院黑鸡蓝壳蛋遗传研究[J].西南农业大学学报，1994（03）：212-214.

[5] 王晨，张丹萍，张浩，等.5个绿壳蛋鸡群体中EAV-HP在SLCO1B3基因5′-非编码区插入整合频率和类型的研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（10）：183-188.

[6] 刘嘉，李富贵，覃飞，等.旧院黑鸡绿壳蛋群体的筛选及其与东乡绿壳蛋鸡纯系杂交后代的生产性能杂种优势分析[J].四川农业大学学报，2018，36（06）：839-844+850.DOI：10.16036/j.issn.1000-2650.2018.06.019.

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[12] 徐恢仲，单天锡，许由，等.旧院黑鸡蓝壳蛋遗传研究[J].西南农业大学学报，1994（03）：212-214.

Molecular marker screening and application of assisted breeding of pure green-shelled eggs of Jiuyuan black chicken in Wanyuan City， Sichuan Province

ZHANG Danping LI Chun HAN Jianlin

（1.Dazhou Animal Husbandry Technology Promotion Station， Dazhou  635000， China;

2.Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Beijing 100193， China;

3.International Livestock Research Institute（ILRI）， Nairobi 00100， Kenya）

Abstract： 【Objective】The purpose of this study is to use molecular markers to screen pure green-shelled egg old-style black chickens， and lay a foundation for the later establishment of a core group of pure green-shelled eggs from old-style black chickens. 【Method】In 1000 old-yard black chicken populations， DNA molecular markers were used to screen pure green-shell egg old-yard black chickens by using the insertion and integration of EAV-HP and ALV. The distribution of the black chicken population in the hospital was studied， and the genotype frequency and gene frequency of green shell eggs and invisible white feather in the black chicken population of the old hospital were studied. 【Result】A large number of EAV-HP insertion integrations were detected in the Jiuyuan black chicken population， but there were only a small number of green-shell eggs homozygous （genotype LC/LC） individuals， accounting for 15.7% of the Jiuyuan black chicken population ; A small amount of ALV insertion and integration was detected in the old hospital black chicken population， no homozygotes， only 18 （genotype N/C， C/C） invisible white feather heterozygotes， accounting for 1.93% of the entire population. 【Conclusion】Using DNA molecular marker-assisted breeding technology， pure line green-shell hens without invisible white feathers were obtained， and the green-shell egg rate was 100%.

Keywords：  Jiuyuan chickens;Molecular marker; EAV-HP;ALV