高强 张浩 任海龙 阿布都克尤木•阿不都热孜克 符小发 张龑 周勃 徐麟

摘要 采用触杀法研究了刺角瓜无水乙醇提取物对南方根结线虫2龄幼虫的毒杀活性。结果表明，不同浓度的刺角瓜无水乙醇根和茎叶提取物对南方根结线虫有不同程度的毒杀活性，其中，用1.00 mg/mL的刺角瓜根、茎叶乙醇提取物分别处理，24 h后南方根结线虫校正死亡率分别为98.95%、94.46%，48 h后南方根结线虫校正死亡率分别为100%、98.12%，与1.00 mg/mL阿维菌素的活性无明显差异。毒力测定结果表明，茎叶提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.703 2和0.450 3 mg/mL;根提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.493 5 和0.484 2 mg/mL。此外，根提取物和茎叶提取物的杀线虫活性表现出明显差异。

关键词 刺角瓜;提取物;南方根结线虫;触杀活性

中图分类号 S 476  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）08-0122-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.033

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The Contact Activity of Extracts from Cucumis metuliferus against Meloidogyne incognita

GAO Qiang 1，2，ZHANG Hao 1，REN Hai-long 3 et al

（1.Hainan Sanya Crops Breeding Trial Center of Xinjiang Academy Agricultural Sciences， Urumqi，Xinjiang  830091;2.Institute of Crop Germplasm Resources of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang  830091;3.Guangzhou Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510335）

Abstract The contact toxicity of ethanol extract from Cucumis metuliferus against the 2nd instar larvae（J2） of Meloidogyne incognita was studied. The results showed that different concentrations of ethanol extracts from roots and stems and leaves of Cucumis metuliferus had different degrees of toxic activity against Meloidogyne incognita. The corrected mortality rates of Meloidogyne incognita were 98.95% and 94.46% 24 h after treatment with 1.00 mg/mL ethanol extracts from roots and stems and leaves of Cucumis metuliferus， and 100% and 98.12% 48 h after treatment， respectively， which were not significantly different from the activity of 1.00 mg/mL abamectin. The results of toxicity test showed that the LD50 of stem and leaf extracts to Meloidogyne incognita were 0.703 2  and 0.450 3 mg/mL respectively after 24 and 48 h treatment. After 24  and 48 h of root extract treatment， the LD50 of root extract against Meloidogyne incognita was 0.493 5  and 0.484 2 mg/mL， respectively. Nematicidal activity of root extract and stem and leaf extract showed significant difference.

Key words Cucumis metuliferus;Extractive;Meloidogyne incongnita;Contact activity

根結线虫（Meloidogyne spp.）是一种高度专化型的植物病原线虫，主要危害植物的根部，造成植株产量降低，甚至死亡。南方根结线虫（M.incognita）寄主范围广，在国内分布最广，危害最大，可加重土传性真菌危害和大部分细菌病害的发生，严重威胁全世界西甜瓜、蔬菜、粮食作物等作物的生长 [1-5]。我国根结线虫的防治目前仍以化学防治为主，但由于目前主要使用的化学农药如溴甲烷、克百威、噻唑磷、阿维菌素等具有高毒性、高土壤残留，对生物安全和环境造成极大的威胁，一些化学杀线剂相继被国家禁用 [6-7]。植物源农药由于易分解为无毒物质、对环境友好等优点成为研究开发的重点对象 [8]。由于长期的协同进化，植物通过物理阻断、产生具有杀线虫活性的次生代谢产物等形式使自身对根结线虫产生抗性，这些次生代谢产物逐渐成为研制新型植物源杀线虫剂的突破点和研究热点 [9-12]。刺角瓜（Cucumis metuliferus Mey ex Naud）为原产于非洲的黄瓜属野生近缘种，其优异的根结线虫抗性受到众多遗传学者的关注。Walters等 [13-16]研究证实刺角瓜对根结线虫有显著的抗性，可以有效抑制根结线虫的生长发育，并具有较强的热稳定性。叶德友等 [17]对刺角瓜根系中参与调控的植物免疫反应WRKY基因进行了克隆和表达分析，发现CmWRKY20表达表现为抗病材料高于感病材料。但对于刺角瓜根和茎叶提取物对根结线虫的活性研究未见报道，影响了刺角瓜根结线虫抗性机制的进一步研究。笔者以南方根结线虫为供试线虫，获得刺角瓜根和茎叶的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取分离物，进行室内线虫抑杀活性评价，旨在为刺角瓜抗线虫研究和植物源杀线剂研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验植物

供试材料刺角瓜于2020年7月采自新疆农业科学院海南三亚农作物育种试验中心南繁基地，采集部位为刺角瓜的根和茎叶。

1.2 南方根结线虫

供试南方根结线虫为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所线虫实验室培养。具体分离培养方法：

①将采集到的感染根结线虫的植物根系用清水清洗干净，用剪刀剪成约1 cm长，放入豆浆机至500 mL量杯的1/3～2/3处，加入无菌水和适量次氯酸钠（约5 mL），进行根组织破碎3～5 s。

②将破碎后的根组织通过35、200和500目的筛子，500目筛子中即得到分离出的根结线虫的卵块和寄生早期幼虫。

③准备1个自制线虫孵化器（从下至上依次为培养皿、20目网筛，网筛上铺盖2层手帕纸），将收集的根结线虫卵块转入手帕纸上，加水至界面，于25～28 ℃孵化幼虫，4 d后收集幼虫（2龄幼虫）。收集到的线虫放置自然沉降，用胶头滴管将表面清水吸出。

1.3 植物提取液的制备

将新鲜的刺角瓜根茎叶，用铡刀轧成小段，按照样品（M）∶溶液（V）=1∶30加入乙醇冷浸7 d，过滤得滤液1，样品再加入等量乙醇超声4 h再过滤得滤液2。将滤液1和滤液2合并50 ℃减压浓缩得到浸膏（乙醇提取物19.440 8 g，得率17.2%），浓缩得到的浸膏无菌水溶解用作室内杀虫试验 。

1.4 样品悬液制备

将1.0 mg样品分别用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μL无菌水溶解得到5个浓度梯度溶液。

1.5 杀线虫活性测定

在96孔板，每孔加入线虫悬液（200～300条线虫），无菌水95 μL，样品溶液5 μL，样品终浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL，空白对照为用等量的无菌水替代样品溶液，阳性对照为用等量的1 mg/mL阿维菌素水溶液替代样品溶液，3次重复，96孔板周围的孔加200 μL无菌水保湿。混匀后于室温下培养24 h，于荧光数码生物显微镜下计数线虫死亡数，统计的线虫数量不少于100条。分别计算线虫的死亡率和校正死亡率。

参照杀线虫活性强弱分级标准进行分级。具体分级标准：“-”表示无活性，校正死亡率≤10%;“+”表示弱活性，校正死亡率为10%～30%;“++”表示中等活性，校正死亡率为30%～50%;“+++”表示较强活性，校正死亡率为50%～80%;“++++”表示强活性，校正死亡率>80%。

线虫死亡率=死亡线虫数/供试线虫数×100%

线虫校正死亡率=（处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率）/（1-对照组线虫死亡率）×100%

1.6 数据处理与分析

使用蓝宙工作室的LD50数据处理软件1.01和SPSS 19.0分析，供试样品浓度（μg/mL）取对数（X），抑制率（%）换算成生物统计概率值（Y），求得抑制活性回归方程（Y=aX+b），从而可以求得半抑制浓度（LD50）值，并进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 刺角瓜提取物的杀线效果

刺角瓜无水乙醇提取物抑杀南方根结线虫的毒力测定结果见表1，部分测定效果见图1和图2。结果表明，1.00～4.00 mg/mL植物茎叶及根的乙醇提取物对南方根结线虫均表现出强毒杀活性，且校正死亡率随着南方根结线虫暴露时间的延长和提取物浓度上升而上升。用浓度为1.00 mg/mL茎叶或根的提取物分别处理24 h后南方根结线虫校正死亡率均超過90%，处理48 h后，线虫校正死亡率均超过98%。当浓度为1.00 mg/mL时，根提取物对南方根结线虫24和48 h校正死亡率均大于茎叶提取物;当浓度大于1.00 mg/mL时，根提取物对南方根结线虫24 h校正死亡率大于茎叶提取物。

差异显著性分析结果表明，刺角瓜茎叶提取物及根提取物对南方根结线虫的活性存在极显著差异，1.00、2.00和4.00 mg/mL的南方根结线虫校正死亡率均极显著大于0.50、0.25 mg/mL和无菌水对照处理。茎叶提取物2.00 mg/mL时，南方根结线虫校正死亡率48 h达100%;根提取物2.00 mg/mL 24 h和1.00 mg/mL 48 h的南方根结线虫校正死亡率均达100%。当刺角瓜根和茎叶提取物的浓度≥1 mg/mL时，南方根结线虫校正死亡率与1 mg/mL阿维菌素致死率相当。

2.2 刺角瓜提取物对南方根结线虫的半致死浓度

刺角瓜提取物对南方根结线虫的抑制活性见表2。由表2可知，茎叶提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.703 2和0.450 3 mg/mL。根提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.493 5和0.484 2 mg/mL。根提取物对南方根结线虫的24 h半致死浓度LD50明显小于茎叶提取物，48 h半致死浓度LD50与茎叶提取物接近。

3 结论与讨论

采用触杀法测定刺角瓜提取物对南方根结线虫的毒杀活性，结果发现不同部位的提取物对南方根结线虫有一定的差异，这与一些相关研究类似 [18]。用1.00 mg/mL的刺角瓜根与茎叶乙醇提取物分别处理，24 h后南方根结线虫校正死亡率均超过94%，48 h后均超过98%，杀线虫活性与阳性对照1 mg/mL阿维菌素相当。茎叶提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.703 2和0.450 3 mg/mL。根提取物处理24和48 h，对南方根结线虫的半致死浓度LD50分别为0.493 5和0.484 2 mg/mL。根提取物的24 h杀线虫活性明显高于茎叶提取物，48 h杀线虫活性接近，说明刺角瓜提取物均可以有效抑杀菌方根结线虫，根提取物的活性成分浓度可能高于茎叶提取物，有待进一步研究。

刺角瓜，商品名火参果，由于其独特的外观、口感及营养价值和含有较多的优异遗传抗性（尤其是根结线虫抗性），被引进到国内推广种植 [19-22]。研究表明，刺角瓜对南方根结线虫有显著的抗性，线虫侵入后取食位点（巨大细胞）形成受阻，可抑制根结线虫的生长发育，这种抗性在刺角瓜（PI202681）中表现为单显性基因控制 [23]。该研究发现刺角瓜的根茎叶提取物均可以抑杀南方根结线虫，认为刺角瓜是合成某种次生代谢产物对根结线虫有一定的毒性，由于植物中含量较少，抑制了根结线虫的生长发育。

研究表明，植物源分离出的化合物中对南方根结线虫具有较好毒杀活性的化合物有对苯二酚、DL-薄荷醇、丁子香酚、丁子香酚、香茅醇、DL-薄荷醇、柠檬酸、马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃内酰胺W、saropeptate、2-（1-oxononadecyl）aminobenzoic acid、草酸、巴豆酸、酒石酸、扁桃酸、苹果酸和苦豆碱 [24-27]等。张志阳等 [28]对刺角瓜的化学成分进行了研究，结果表明，火参果中含有氨基酸、有机酸、生物碱、黄酮及苷类、鞣质、植物甾醇、三萜、油脂、糖、氰苷成分。该研究为进一步研究刺角瓜根结线虫抗性机制提供了依据，同时，从刺角瓜中分离、提纯杀线虫化合物并鉴定其化学结构，并与高活性植物源杀线虫化合物进行活性-结构相关性研究，明确其作用机理，为开展仿生合成环境友好性、耐储存、成本低的新型生物农药提供思路。

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