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柚子幼果精油的提取及其抗氧化活性研究

2022-05-05庄姗姗刘袆帆张沁铭肖更生戴宏杰马路凯

轻工学报 2022年2期
关键词:幼果柚子精油

庄姗姗,刘袆帆,2,张沁铭,肖更生,戴宏杰,马路凯,4

1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院/广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室,广东 广州 510225;2.广东省梅州市梅县区农业科学研究所,广东 梅州 514783;3.西南大学 食品科学学院,重庆 400715;4.仲恺农业工程学院 现代农业创新研究院,广东 广州 510225

0 引言

我国南方柚子种植历史悠久、技术成熟、面积广泛,其中广东省梅州市的沙田柚更是味道鲜甜、脆嫩爽口、品质优良。柚子幼果泛指未成熟的柚子,包括生理落果和人工疏果,通常因未发育完全、直径较小、果皮青绿、无法食用而被丢弃。柚子幼果大部分为果皮,挥发性精油含量丰富,主要成分为单萜类化合物和柠檬烯[1]。当生物体体内产生过量自由基,其诱导生成的有害物质会对细胞造成严重损伤[2]。而大量文献[3-7]研究表明,植物精油具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗高血压等药理特性,其中抗氧化活性效果显著,可以从源头抑制生物体内自由基的产生,或直接清除已存在的自由基[8]。目前,关于柚子幼果的研究多集中于化学成分分析和提取工艺,柚子幼果精油作为柚子幼果中活性组分之一,受到的关注仍较少[9-12]。

成熟的红细胞结构简单,无细胞核或细胞器,无复杂的代谢路径,可产生辅酶因子以抵抗氧化应激[13]。同时,红细胞模型较接近有机体的真实状态,适用于抗氧化能力的研究,尤其是进行细胞抗氧化酶体系的研究评价[14]。亚临界流体萃取是一种新兴技术,与传统的超临界流体萃取相比,其可以在更低的温度和压力下进行物质萃取,且能耗更低,有助于降低生产成本[15]。基于此,本研究以柚子幼果为原料,拟采用亚临界流体萃取技术萃取其精油,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对精油成分进行测定分析,应用AAPH(偶氮二异丁脒盐酸盐,水溶性自由基引发剂)诱导红细胞氧化应激模型评价柚子幼果精油的抗氧化活性,初步探究柚子幼果精油的抗氧化能力和机理,为柚子幼果的开发利用提供理论依据,也为柚子幼果精油在食品保鲜等领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

沙田柚幼果,采自广东省梅州市。

1.2 主要试剂

石油醚、无水乙醇,广州市一马试剂仪器有限公司产;AAPH,上海瑞永生物科技有限公司产。以上试剂均为分析纯。磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液,pH值为7.2),北京雷根生物技术有限公司产;非酶抗氧化剂(GSH)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒,南京建成生物工程研究所产。

1.3 主要仪器与设备

CBE-10 L型亚临界萃取实验室成套设备,河南省亚临界生物技术有限公司产;RV10型德国IKA旋转蒸发仪,武汉集思仪器设备有限公司产;FD-1C-50型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司产;HH-2型数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司产;TGL16E型低速离心机,广州芯康医疗科技有限公司产;6980 N/5975B型气质联用仪,美国 Agilent 公司产;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司产;SH-1000型酶标仪,山东博科科学仪器有限公司产;YB-700A型高速多功能粉碎机,永康市铂欧五金制品有限公司产。

1.4 实验方法

1.4.1 原料预处理将柚子幼果大致切成边长1~2 cm的正方块,冷冻干燥后,置于高速多功能粉碎机中粉碎数分钟,过60目筛,得到柚子幼果粉,分袋装好并密封,置于干燥避光处保存,备用。

1.4.2 柚子幼果精油的亚临界流体萃取取800 g柚子幼果粉,用干净纱布袋装好,放入亚临界萃取实验室成套设备的萃取釜中,以丁烷为萃取剂、石油醚为夹带剂,于50 ℃萃取45 min,得到精油粗产品;对精油粗产品继续进行50 ℃旋转蒸发浓缩后,加入5 mL无水乙醇进行溶解,置于-20 ℃冰箱中冷冻,低温过滤后真空浓缩,于3000 r/min 条件下离心20 min,过滤得到黄色澄清液体,即为柚子幼果精油[16]。

1.4.3 柚子幼果精油化学成分测定GC条件:色谱柱为Agilent HP-5 MSUI(30 m×250 μm×0.25 μm);进样体积为1 μL;进样口温度为280 ℃;载气为He,不分流,流速为1.3 mL/min;起始温度为60 ℃,以10 ℃/min升温至300 ℃。

MS条件:电子轰击(EI)离子源,离子源为70 eV,离子源温度为230 ℃,质谱接口温度为250 ℃,传输线温度为280 ℃,质量扫描范围 (m/z)为30~500 amu[17]。

1.4.4 柚子幼果精油抗氧化活性研究1)红细胞溶血率的测定。取适量柚子精油,用 PBS 缓冲液充分溶解后,在 420 nm 波长处测定该溶液黄酮类物质的质量浓度,最终配制成质量浓度为 0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL 的待测液。将预处理后体积分数为6%的红细胞悬液装于 0.2~5.0 mL 离心管中,加入配制好的待测液,充分混匀后置于37 ℃培养箱内避光缓慢振荡孵育30 min;加入AAPH溶液(200 mmol/L)充分混匀,在相同条件下继续孵育2.5 h。每个处理组均设 3 个平行[18]。孵育结束后,将反应液于4 ℃、3000 r/min条件下离心10 min,取0.2 mL上清液置于96 孔板中,使用酶标仪于540 nm波长处测吸光值A。取相同体积分数的红细胞悬液,加入等体积的水后进行裂解,同样于540 nm波长处测吸光值B。以未经AAPH 溶液处理且未添加柚子幼果精油的红细胞悬液为空白对照组,以经AAPH 溶液处理且未添加柚子幼果精油的红细胞悬液为阳性对照组。溶血率按照以下公式计算:

溶血率=A/B×100%

2)抗氧化活性研究。取适量预处理后的红细胞,加入 PBS 缓冲液洗涤2~3次,加入约4倍体积超纯水裂解细胞,冰浴后于3000 r/min,4 ℃条件下离心5 min;离心完毕后,取上清液保存于-40 ℃冰箱中,备用。按上述1)的方法配置质量浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL 的待测液。GSH-Px、LDH、CAT的测定按照试剂盒的提示进行。以上实验均重复3次。

1.5 数据处理

使用 SPSS 25.0软件进行数据分析和差异显著性分析(P<0.05),结果表示为(平均值±标准差),用 Origin 2019对分析数据作图,红细胞溶血保护作用机理图由AI制作。

2 结果与分析

2.1 柚子幼果精油成分分析

GC-MS总离子流谱图如图1所示。由图1可以看出,峰段主要集中出现在13~33 min阶段,从峰段中共检测出300种化学成分,并确定了其中126种化学成分。这126种有效化学成分主要包括7类化合物,分别为醇类、萜烯类、酮类、酯类、醛类、酚类和烷烃类。醇类为主要化合物,共11种,相对含量为16.43%,其中植物甾醇相对含量为4.09%。萜烯类共10种,相对含量为5.37%,γ-松油烯、角鲨烯、3-蒈烯是其主要成分,其中γ-松油烯相对含量最高,为4.14%。酮类共10种,相对含量为3.71%。酯类共19种,相对含量仅为2.73%,其中,2-棕榈酰甘油是其主要成分,相对含量超过1%。醛类共3种,相对含量为0.19%。酚类共43种,相对含量为0.19%。烷烃类共11种,相对含量为4.64%。

图1 GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatogram of GC-MS

2.2 柚子幼果精油抗氧化活性分析

2.2.1 对红细胞溶血的保护作用柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞溶血率的影响如图2所示,其中不同小写字母表示差异显著(P<0.05);+表示添加AAPH溶液,-表示未添加,下同。由图2可以看出,与空白对照组相比,经AAPH处理后的阳性对照组,红细胞的溶血率显著增加,达(52.79±0.80)%,这说明AAPH能够引起红细胞溶血。加入不同质量浓度的柚子幼果精油后,红细胞的溶血率呈缓慢降低趋势,其中柚子幼果精油的质量浓度越高,红细胞的溶血率越低,这说明柚子幼果精油对损伤的红细胞具有保护作用。已有研究[19]证明,柚子幼果中含有大量的黄酮类等能够清除自由基的活性物质,可抑制由AAPH诱导的红细胞溶血。

图2 柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞溶血率的影响Fig.2 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on hemolysis rate in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.2 对脂质过氧化的抑制作用在生物体内,当自由基对细胞进行攻击时,细胞膜上会产生脂质过氧化反应,而MDA作为该胁迫反应过程中的一种生物标志物,浓度会升高,导致细胞结构和功能遭到破坏[20]。柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内MDA浓度的影响如图3所示。由图3可以看出,当红细胞遭到AAPH胁迫时,产生的大量MDA会对红细胞造成损伤。空白对照组产生的MDA浓度为(28.35±3.60) nmol/mL。未添加柚子幼果精油并直接受到AAPH攻击的阳性对照组的MDA浓度为(53.37±7.91) nmol/mL。经不同质量浓度的柚子幼果精油预处理后的红细胞,MDA浓度变化与阳性对照组有较大差异,其中精油质量浓度为1 mg/mL时,MDA产生的浓度最低,这说明该质量浓度下的柚子幼果精油对AAPH诱导产生的MDA有较强的抑制作用。

图3 柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内MDA浓度的影响Fig.3 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on MDA content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.3 对细胞膜的保护作用柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内LDH释放量的影响如图4所示。由图4可以看出,空白对照组的红细胞内LDH释放量最低,为(144.96±3.27) U/L。阳性对照组的红细胞内LDH释放量显著增加,达(470.85±3.18) U/L,这可能是因为AAPH攻击红细胞时产生的大量活性氧会破坏红细胞的细胞膜,从而导致细胞内的LDH酶被释放[21]。而经不同质量浓度的柚子幼果精油处理后,随着柚子幼果精油质量浓度的增加,LDH释放量显著降低,这说明,一定质量浓度的柚子幼果精油能够保护细胞膜免受氧化损伤,从而抑制LDH向细胞外释放。

图4 柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内LDH释放量的影响Fig.4 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on LDHrelease content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.4 对非酶促抗氧化的影响GSH是细胞内一种具有较强抗氧化作用的非酶抗氧化剂。柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内GSH浓度的影响如图5所示。由图5可以看出,经AAPH处理后的阳性对照组,红细胞内GSH浓度最低,这说明AAPH处理细胞后能引起细胞的氧化损伤[22]。而经柚子幼果精油处理后,红细胞内GSH浓度呈上升的趋势,这说明柚子幼果精油处理能显著提高细胞的抗氧化活性,从而起到清除自由基的作用。

图5 柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内GSH浓度的影响Fig.5 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on GSH content in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.5 对酶促抗氧化体系的影响红细胞内的抗氧化酶体系主要包括SOD、GSH-Px和CAT。SOD 通过歧化作用,可催化高氧化活性超氧化物的阴离子转化为低氧化性的氧和H2O2,从而起到清除自由基的作用[23],而CAT和GSH-Px可将H2O2转化为O2和H2O[24]。柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内SOD、GSH-Px和CAT活性的影响如图6所示。由图6可以看出,空白对照组的抗氧化酶体系的活性最低。而经AAPH处理的阳性对照组的抗氧化酶体系活性最高,这可能是因为红细胞在受AAPH刺激后,激发了细胞内的防御体系保护细胞。经柚子幼果精油处理后,抗氧化酶体系的活性显著降低,并对精油质量浓度形成剂量依赖性。因此,柚子幼果精油可能是通过直接抑制由AAPH诱导的MDA形成以减少对细胞膜的损伤作用,同时调节细胞内抗氧化酶的活性,从而起到抗氧化的作用。

图6 柚子幼果精油对AAPH处理后红细胞内SOD、GSH-Px和CAT活性的影响Fig.6 Effect of grapefruit fruitlet essential oil on activity of SOD, GSH-Px and CAT in erythrocytes after AAPH treatment

2.2.6 柚子幼果精油抑制红细胞溶血机理的推测柚子幼果精油抑制 AAPH诱导红细胞溶血的机理如图7所示。由图7a)可以看出,当自由基引发剂AAPH刺激红细胞时,O2-、H2O2等活性自由基(ROS)含量会增加,ROS物质含量过多会破坏蛋白质导致细胞凋亡;同时,细胞膜上的不饱和脂肪酸遇到ROS会发生脂质过氧化反应,产生大量 MDA,破坏磷脂双分子层,从而引起细胞损伤,胞内LDH被释放,最终造成红细胞溶血。红细胞内存在的酶促抗氧化防御体系启动,一方面,SOD会催化O2-发生歧化反应生成较为安全的H2O2,或者CAT将细胞内所含的H2O2和SOD催化产生的H2O2一同转化为H2O;另一方面,GSH-Px与GSH通过相互作用生成H2O。而此时,红细胞内的非酶促防御体系也会发生协调作用,当细胞发生氧化应激时,GHS(谷胱甘肽)发生氧化反应,生成GSSH(氧化型谷胱甘肽),过多的GSSH会在还原酶的作用下还原成GSH。降低GSH与GSSH的转化效率有助于抑制脂质过氧化反应[24-27]。酶促抗氧化和非酶促防御体系以多种途径协调作用,不断清除或抑制对机体有害的自由基,维持动态平衡,让红细胞可以进行正常的生命活动。

图7 柚子幼果精油抑制AAPH引起氧化损伤的胞内抗氧化机理Fig.7 Intracellular antioxidant mechanism of grapefruit fruitlet essential oil inhibiting oxidative damage caused by AAPH

若自由基长时间对红细胞发起攻击,红细胞内的防御体系将无法清除过多的自由基,从而破损凋亡。如图7b)所示,加入柚子幼果精油后,红细胞的溶血率有效降低,MDA浓度和LDH释放量在红细胞外显著减少,说明细胞膜得到了保护,红细胞的完整性得以维持,这也是抑制红细胞溶血的直接原因。在前期GC-MS检测的有效化学成分中,生育酚、菜油甾醇、维生素E、植物甾醇等[28]都具有抗氧化功效,同时柚子幼果中含有大量黄酮类活性物质[15],笔者推测柚子幼果精油中的这些物质共同作用清除了自由基,避免了自由基造成的氧化损伤,维持了酶促抗氧化和非酶促防御体系之间的平衡,抑制了AAPH刺激引发的红细胞溶血。

3 结论

本文以柚子幼果为原料,采用亚临界流体萃取技术提取了柚子幼果精油,利用GC-MS联用技术对该精油的化学成分进行分析发现,柚子幼果精油共鉴定出126种有效成分,包括醇类、萜烯类、酮类、酯类、醛类、酚类和烷烃类7类化合物,主要以醇类化合物为主,其相对含量为16.43%,萜烯类相对含量为5.37%,酮类相对含量为3.71%。通过AAPH诱导红细胞氧化应激模型对柚子幼果精油的抗氧化活性进行了研究,结果表明,柚子幼果精油具有抗氧化活性,其抑制红细胞溶血的机理可能是AAPH诱导形成MDA,从而减少对红细胞细胞膜的损伤,同时调节细胞内酶促抗氧化和非酶促防御体系之间的平衡,实现抗氧化的作用。本研究可为柚子幼果资源的深度开发利用提供参考,也可为柚子幼果精油在市场中的实际应用提供研究基础。

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