李静尧，杨 博，拓晓丹，王继飞，李小伟

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局，宁夏 银川 750021）

沙棘（Hippophae）属胡颓子科，为落叶灌木，分布于华北、西北、西南等地，具有抗旱、抗寒、抗盐碱等特性，因此被广泛用于水土保持、防风固沙和改良土壤等，现已成为西北干旱、半干旱区的重要植物资源[1]。

中国是世界上沙棘资源最丰富的国家，有7种和7亚种[2]。横断山和东喜马拉雅地区是沙棘属植物类群分布中心、原始类群中心和类群分化中心。沿着中国的森林-草原过渡带分布着7种5亚种，存在明显的替代分布。其中中国沙棘（H.rhamnoides）从黄土高原东部分布到青藏高原东缘，海拔范围800~3 300 m，是沙棘属中分布范围最广、蕴藏量最大的物种，有重要的生态和经济价值；肋果沙棘（H.neurocarpa）分布于青藏高原东南缘，海拔范围3 400~4 300 m；西藏沙棘（H.tibetana）分布于青藏高原东南缘，海拔范围2 800~5 200 m，是沙棘属中在青藏高原分布范围最广的物种[3—4]。这种分布格局是物种长期适应环境的结果，而结构是功能的基础，结构的差异和变化必然影响其生理生态功能，进而影响物种的分布。

叶片是植物最重要、可塑性最大的功能器官，因此研究叶片的结构及其对环境的响应，对阐释物种分布格局具有重要意义。低温是影响植物生长发育和地理分布的一个重要生态因子，对植物抗寒性的影响显著大于其他环境胁迫因素[5—6]。有研究表明，在低温环境中，叶片改变其自身结构以适应环境[7]。韩善华等[8]研究了沙冬青，发现其较耐寒，主要表现为叶肉组织发达，分化程度高，栅栏组织厚，排列紧密等；杨宁宁等[9]研究认为，冬油菜的抗寒性与其叶片的栅海比呈正相关；刘星辉等[10]通过香蕉叶片试验发现，叶片的角质层厚度、栅栏组织厚度与品种抗寒性呈正相关，而海绵组织厚度/叶片厚度与品种抗寒性呈负相关；余文琴等[11]研究了荔枝叶片，发现角质层厚度与其抗寒性呈正相关。由此可见植物叶片解剖结构能够指示植物的耐寒性[12]。因此，本文以3种沙棘属植物叶片为材料，使用显微镜观察其永久装片，对比研究沙棘属植物叶片解剖结构的差异，利用隶属函数法评价其耐寒性，以期为中国沙棘、肋果沙棘和西藏沙棘替代分布提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料采集区概况

试验材料包括中国沙棘（H.rhamnoides）、肋果沙棘（H.neurocarpa）、西藏沙棘（H.tibetana）。材料均取自四川省阿坝藏族羌族自治州若尔盖县，地处青藏高原东北边缘，地理坐标为东经102°08′～103°39′、北纬32°56′～34°19′，该地区属高原寒温带湿润季风气候，常年无夏，年平均气温1.1℃，年降水量648.5 mm，无绝对无霜期，降雨多集中于5月下旬—7月中旬，年均相对湿度69%。材料名称及来源见表1。

表1 材料名称及来源

1.2 研究方法

1.2.1取样方法 选取5个沙棘个体，每个个体采集5片发育良好、没有病虫斑的叶片，用FAA固定液（福尔马林-醋酸-酒精混合液）固定，采用常规石蜡切片法（取材、固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、染色、透明、封藏）制作叶片横切面永久装片（每种材料10片装片，每片装片有切片5片，切片厚度为8～10μm），将制片置于olympus显微镜下观察，并用motic image advanced 3.0软件测量并进行显微照相。测定内容为叶片厚度、上表皮和下表皮厚度、栅栏组织与海绵组织厚度、维管束厚度、角质层厚度、木质部厚度与韧皮部厚度。并进行以下计算：栅栏组织厚度/海绵组织厚度、叶片组织结构紧密度、叶片组织结构疏松度、上表皮厚度/下表皮厚度、主脉厚度/叶片厚度、木质部厚度/维管束厚度、韧皮部厚度/维管束厚度、木质部厚度/韧皮部厚度。

1.2.2数据处理 使用microsoft excel 2010和SPSS 21.0软件处理数据，采用单因素方差分析法对各个指标进行差异性分析，采用FUZZY数学中隶属函数值法计算各物种的多个耐寒性指标的综合评判值。隶属函数值计算公式如下：

式中：U（Xi）为隶属函数值；Xi为指标测定值；Xmax、Xmin为某一指标的最大值和最小值。若某一指标与植物的抗旱性呈负相关，则用反隶属函数进行计算，公式如下：

2 结果与分析

2.1 3种沙棘叶片解剖结构的基本特征

观察3种沙棘属植物叶片横切面结构（图1），可知叶片均由表皮、叶肉和叶脉三部分构成。叶片横断面的上、下表皮细胞均为单层，上表皮比下表皮厚，上表皮具发达的角质层。叶肉组织均有明显的栅栏组织与海绵组织的分化，栅栏组织发达，位于叶近轴面表皮下，排列紧密，细胞长短不一，由2～3层发达的柱形细胞规则排列而成；海绵组织细胞疏松，由不规则细胞组成，分布在叶远轴面的下表皮上方，数量少、不发达。叶脉具单一维管束，外韧型，略呈凹槽，均由木质部、少量形成层和韧皮部构成，其中木质部导管呈径向排列，倒伞状分布于韧皮部上方，构成维管束的主要部分。

图1 3种沙棘叶片横切面结构

2.1.1叶表皮结构比较 由表2可知，3种沙棘上表皮平均厚度由大到小分别是西藏沙棘17.87μm、肋果沙棘17.58μm、中国沙棘16.10μm，肋果沙棘与西藏沙棘上表皮厚度没有显著性差异，但两者与中国沙棘差异性显著。下表皮平均厚度为11.68～14.98μm，其中肋果沙棘最厚，西藏沙棘次之，中国沙棘最薄。上、下表皮厚度之比为1.19～1.37，其中西藏沙棘最大，中国沙棘次之，肋果沙棘最小。角质层的厚度变化范围为1.42～1.64μm，中国沙棘最厚，肋果沙棘次之，西藏沙棘最薄。

表2 3种沙棘叶片的解剖特征比较（n=15）

2.1.2叶肉组织比较 西藏沙棘第1层栅栏组织细胞密度为7～9个/100μm，肋果沙棘为6～8个/100μm，中国沙棘为9～10个/100μm；栅栏组织厚度由大到小依次为西藏沙棘177.45μm、肋果沙棘166.78μm、中国沙棘148.66μm；叶片组织结构紧密度由大到小依次为西藏沙棘、肋果沙棘、中国沙棘，没有显著性差异；3种沙棘栅海比均大于1，由大到小依次为西藏沙棘1.14、肋果沙棘1.09、中国沙棘1.03，差异性显著。叶片厚度分别为西藏沙棘355.34μm，肋果沙棘350.64μm，中国沙棘284.37μm。

2.1.3叶脉比较 由表2可知，维管束厚度最大的为中国沙棘，其次为肋果沙棘，西藏沙棘的最小，分别为302.24、168.98、147.11μm，中国沙棘维管束厚度与其余两者差异性显著。而木质部与维管束厚度之比和木质部与韧皮部厚度之比均表现为西藏沙棘最大，肋果沙棘次之，中国沙棘最小，而韧皮部与维管束厚度之比反之，三者有显著性差异。

2.2 3种沙棘属植物耐寒性综合评价

单一的叶片结构指标难以准确全面地反映植物耐寒性的强弱，隶属函数法是目前普遍采用的抗性综合评价方法，能客观反映植物之间的耐寒性差异。本研究选取了9个耐寒性指标：上表皮厚度、栅栏组织厚度、木质部厚度、维管束厚度、主脉厚度、上表皮厚度/下表皮厚度、栅栏组织厚度/海绵厚度、木质部厚度/维管束厚度、叶片组织结构紧密度，这些指标均与耐寒性呈正相关。利用隶属函数来评价沙棘属植物的耐寒能力，其数值越大表明耐寒性越强。虽然其他指标对叶片的耐寒性分析也具有一定意义，但根据可比性和可测性原则，这些指标可用另外的指标替代或采用综合多指标分析其耐寒性。3种沙棘属植物耐寒性综合评价值：西藏沙棘为0.53，肋果沙棘为0.51，中国沙棘为0.45，耐寒能力由强到弱依次为西藏沙棘、肋果沙棘、中国沙棘（表3）。

表3 3种沙棘耐寒指标的隶属函数值、耐寒性综合评价及排序

3 讨论与结论

植物的耐寒性是受多方面因素控制的复合遗传性状，单一的耐寒性鉴定指标难以真实反映植物的耐寒性，只有采用多项指标进行综合评价，才能比较准确地反映出植物的耐寒性。隶属函数法在多指标测定的基础上对植物的某一特性进行综合评价，能有效避免因采用单个指标进行评价而造成的片面性[13]。隶属函数分析作为一种有效的方法已广泛应用于桃（Prunus persica）[14]、油茶（Camellia oleifera）[15]、卫矛属（Euonymus）[16]、苔草属（Carex）[17]、核桃（Juglans regia）[18]等植物的抗逆性鉴定。

叶片是植物气体交换和光合作用的器官，与空气完全接触，对外界水热变化敏感，因此叶解剖结构的变化能够反映植物对外界环境的响应[19—20]。不同植物叶片解剖结构与耐寒性的研究结果表明：表皮厚度、叶片组织结构紧密度、栅栏海绵比均与植物耐寒性有重要关系[21—27]。但不同植物的抗寒机制可能会有所不同，影响耐寒性的主要指标也可能不一致，完全按照前人的研究结果，选择已有抗寒指标对3种沙棘的耐寒性进行综合评价，有可能会影响耐寒性鉴定的准确性。本研究从3种沙棘的15个指标中筛选出上表皮厚度、栅栏组织厚度、木质部厚度、维管束厚度、主脉厚度、上表皮/下表皮、栅栏/海绵、木质部/维管束、叶片组织结构紧密度9个指标，作为耐寒性综合评价的主要指标，结果表明，耐寒性由强到弱依次为西藏沙棘、肋果沙棘、中国沙棘。

李瑞雪等[28]、何海旺等[29]的研究结果表明，栅栏组织排列紧密且厚度越大其耐寒性越好，已有研究[30—33]表明，植物的耐寒性与叶片结构紧密度和栅海比均呈正相关。本研究中，西藏沙棘的栅栏组织最厚，这与其耐寒性评价结果为最大值一致；肋果沙棘的叶片组织紧密度最大，但与其耐寒性评价结果为中间值不一致。这说明在评价3种沙棘耐寒性时不能仅仅以某一单项指标作为评价标准，应当考虑多项指标进行综合评价。本研究利用筛选出的9项叶片结构解剖指标对3种沙棘的耐寒性进行了初步评价，然而要想准确评价沙棘的耐寒性，还需要结合分子生物学、抗寒生理生化等方面因素加以综合考虑。

综上所述，本研究结果表明：叶片的解剖结构是沙棘属植物出现替代分布的重要影响因素。