李俊，陈伟，杨明武，何珺

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025;2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025)

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgobilobea.L.)的干燥叶,味微苦,性平,具有益心、活血止痛等功效[1-4]。银杏叶中的活性成分有黄酮、萜内酯和有机酸等[5]，其中奎宁酸和莽草酸含量高达3%～5%。奎宁酸具有抗氧化性[6]，莽草酸具有抗菌、抗炎等药理活性[7]。

莽草酸、奎宁酸为合成达菲原料[6，8]。目前市场上莽草酸主要来源于八角，但近年来八角价格不断攀升，导致工业成本提高，市场急需寻求低价原料代替[9-11]。在银杏叶中黄酮及内酯提取工艺基础上[7]，对莽草酸和奎宁酸进行综合提取工艺研究，充分利用银杏叶资源。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

奎宁酸对照品(批号20112423，上海同田生物技术股份有限公司，含量>98%)；莽草酸对照品(批号20111203，上海同田生物技术股份有限公司，含量>98%)；磷酸、无水乙醇均为分析纯；娃哈哈纯净水；甲醇，色谱纯；蒸馏水,自制;银杏叶，4月采自贵州省遵义市湄潭县3年树龄的银杏，60 ℃真空干燥24 h。

Agilent Technologies 1260 InfinityHPLC-示差检测器;BT25S电子分析天平；HH.W21-600C型电热恒温水浴锅。

1.2 提取实验

按料液比1∶10 g/mL;加入体积分数85%的乙醇，在70 ℃提取2 h。

1.3 奎宁酸和莽草酸含量测定

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇：0.4%磷酸水(1∶99，v/v)；柱温35 ℃；流速0.8 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 溶液制备 分别取奎宁酸、莽草酸对照品适量，精密称定，加水制得对照品溶液。精密称定银杏叶1.00 g，按照相应条件提取，精密移取银杏叶提取液1 mL，以水定容至10 mL，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，注入进样瓶，即得供试品溶液。按拟定色谱条件进行含量测定，结果见图1、图2。

图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of the test product

1.3.3 标准曲线绘制 精密量取 0,2.4,4,6,8,10 mL的0.25 mg/mL奎宁酸标准溶液于10 mL试管中，加水稀释至刻度线，混匀，制成系列奎宁酸标准溶液；精密量取0,1.6,3.2,3.5,4.8 mL的0.15 mg/mL莽草酸标准储备液于10 mL试管中，加水稀释至刻度线，混匀，制成系列莽草酸标准溶液。按照拟定方法条件进行含量测定。以奎宁酸质量浓度(mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=115 477X+136.4，r=0.99，表明在0～ 0.25 mg/mL 范围内，峰面积与奎宁酸浓度有良好的线性关系。以莽草酸质量浓度(mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=132 125X+190.39，r=0.99，表明在0～0.30 mg/mL 范围内，峰面积与莽草酸浓度有良好的线性关系。

2 结果与讨论

2.1 提取温度

料液比1∶10 g/mL,乙醇体积分数85%，提取时间2 h，考察提取温度对提取效果的影响,结果见表1。

表1 提取温度对奎宁酸和莽草酸提取影响(n=3)Table 1 The effect of extraction temperatures on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表1可知，随着温度升高，银杏叶中奎宁酸和莽草酸提取率越高，70,90 ℃时，奎宁酸和莽草酸提取含量最高，达3.8%左右，变化不大。因此，优先提取温度为70 ℃。

2.2 提取醇浓度

料液比1∶10 g/mL，提取温度70 ℃，提取时间2 h，考察乙醇体积分数对提取效果的影响,结果见表2。

表2 乙醇浓度对奎宁酸和莽草酸提取影响(n=3)Table 2 The effect of ethanol concentrations on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表2可知，乙醇浓度越高，奎宁酸提取率越低，而莽草酸整体提取率变化不大。乙醇体积分数在30%时，奎宁酸含量达4.5%，莽草酸含量达3.9%，综合提取率最高。但是，先前对银杏叶中黄酮、内酯、莽草酸综合提取研究表明，采用乙醇浓度为70%最好，而70%乙醇提取奎宁酸提取效果为30%提取时的84.3%。因此，考虑银杏叶中黄酮、内酯、莽草酸三个组分提取效率，确定提取溶剂为70%乙醇。

2.3 提取时间及次数的考察

料液比为1∶10 g/mL，提取温度为70 ℃，乙醇体积分数为70%，每次提取1 h，每次提取后进行抽滤，滤渣进行下一次提取。提取次数对提取效果的影响见表3。

表3 提取次数对提取效果的影响(n=3)Table 3 The influence of the number of extractions on the extraction effect(n=3)

由表3可知，第1次提取时，莽草酸提取率达70.35%，奎宁酸提取率达60.15%；第2次提取时，莽草酸总的提取率达20.55%，奎宁酸总的提取率达25.78%；第2次提取时，奎宁酸总的提取率为9.97%，莽草酸总的提取率为6.88%；第4次提取时，奎宁酸和莽草酸的提取率低至3.33%和2.33%。因此，综合生产成本考虑，确定提取2次，第1次提取2 h，2次提取1 h，总的提取时间为3 h，奎宁酸总的提取率为96.67%，莽草酸总的提取率为97.77%。

2.4 正交实验

在单因素实验基础上，对料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行正交实验，因素水平见表4，结果见表5，方差分析见表6、表7。

表4 因素水平表(n=3)Table 4 Factor and level table (n=3)

表5 正交实验结果(n=2)Table 5 Orthogonal experimental results (n=2)

表6 奎宁酸提取方差分析Table 6 Results of analysis of variance of quinic acid

表7 莽草酸提取方差分析Table 7 Analysis of variance results of shikimic acid

由表5可知，莽草酸含量变化不大，而奎宁酸含量波动较大。所以，将奎宁酸作为正交提取含量考察主要指标，因素的影响强度依次为B>D>C>A,A1B1C3D3为最优方案,即料液比1∶8 g/mL,乙醇体积分数为70%，提取温度为70 ℃，提取时间3 h。

2.5 验证实验

平行取4组1.0 g银杏叶，精密称定，加8 mL体积分数为70%的乙醇溶液，70 ℃条件下，提取2次，即第1次为2 h，第2次为1 h,提取时间3 h。对提取液进行含量测定，综合评分=奎宁酸含量评分+莽草酸含量评分;奎宁酸含量评分=(奎宁酸提取量/奎宁酸最大提取量)×100×0.5;莽草酸含量评分= (莽草酸提取量/莽草酸最大提取量)×100×0.5。结果见表8。

表8 验证实验Table 8 Verification experiment

由表8可知，正交实验所得最佳参数在对银杏叶中奎宁酸和莽草酸进行综合提取时，能够得到稳定高效的提取量，奎宁酸的含量达5.29%，莽草酸含量达4.90%，综合评分达98.51。表明该工艺参数稳定可行，可用于银杏叶中奎宁酸和莽草酸的综合提取。

3 结论

对银杏叶中奎宁酸和莽草酸进行综合提取时，最优条件为：料液比1∶8 g/mL,乙醇体积分数为70%，提取温度为70 ℃，提取时间为3 h。在第1次提取时间达到2 h以后，为避免提取溶液达到饱和状态，采用新的溶剂进行第2次提取，从而达到提高提取率的目的。奎宁酸含量5.29%,莽草酸含量4.90%。