叶晓楠，曾慧慧，刘思琦，李毅翔，黄莉莉，于 爽，李廷利，王艳艳,

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

酸枣（Ziziphus jujubaMill. var.spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou）是鼠李科枣属植物酸枣的干燥成熟果实，为药食同源的中药，始载于《神农本草经》，曰：“酸枣，味酸平，主心腹寒热，邪结气聚，四肢酸痛，湿痹，久服安五脏，轻身延年[1]”，这是古代医籍中有关于酸枣延年益寿的最早记载。现代药理学研究表明，酸枣中富含大量三萜及其皂苷类[2]、黄酮类[3]、糖类[4]、氨基酸类[5]等化学成分，具有镇静催眠[6]、调节免疫[7]、保肝[8]、抗氧化[9−12]等多种生物活性。酸枣不同器官包括果实、果皮、果肉和种仁部位的提取液均被证实有清除羟自由基的作用[9]，目前酸枣已被广泛加工制成酸枣酒[13]、酸枣醋[14]、酸枣汁[15]等食品，然而有关于其体内抗氧化活性以及延缓衰老相关的基础研究较少。

本研究通过DPPH法、羟自由基法、Fe3+还原能力法测定酸枣提取物的体外抗氧化活性，并进一步利用果蝇这一模式生物，研究其对果蝇寿命和抗氧化酶活性的影响，从体外和体内两个角度，探讨酸枣提取物抗氧化和抗衰老作用，为酸枣提取物的开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生型Canton S黑腹果蝇 中国科学院上海生命科学院提供；酸枣果实 产自山西阳泉，选取完整、大小均一、无虫蚀、无损伤的果实，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为鼠李科枣属植物酸枣的干燥成熟果实；水溶性维生素C 中国药品生物制品检定所；DPPH Sigma公司；蔗糖 天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂 北京Biotopped科技公司；丙酸 天津致远化学试剂有限公司；酵母粉

安琪酵母股份有限公司；硫酸亚铁 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；水杨酸 天津巴斯夫化有限公司；铁氰化钾、三氯乙酸 天津永晟精细化工有限公司；以上试剂均为分析纯；FRAP检测试剂盒 碧云天生物科技有限公司；羟自由基、SOD、CAT、MDA测定试剂盒 南京建成生物科技有限公司。

MS204S分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；Synergy MX酶标仪 BIOTEK公司；N-1100D旋转蒸发仪、FDU-1200冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司；CY600恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；D27超声波清洗机 GT SONIC公司；果蝇二氧化碳麻醉装置 自制。

1.2 实验方法

1.2.1 酸枣提取物的制备 依据实验室前期研究基础，用体积分数为50%的乙醇进行提取，乙醇和酸枣的液固比为22:1（mL/g），超声（450 W，50 ℃）提取90 min，过滤，取滤液，浓缩，−40 ℃ 15 Pa冷冻干燥84 h，得酸枣提取物冻干粉备用。其中，总黄酮得率为2.31%、总酚得率为1.98%、多糖得率为18.50%，总皂苷得率为12.62%。

1.2.2 酸枣提取物体外抗氧化活性的测定

1.2.2.1 酸枣提取物对DPPH自由基清除能力的测定 用蒸馏水配制质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸枣提取物样品和VC溶液。取不同质量浓度的样品和VC溶液各0.7 mL，加入1.3 mL 0.3 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光反应完全后在波长517 nm处测定混合物的吸光度值[16−18]。

式中：A0为空白对照吸光度值，A1为样品溶液吸光度值，A2为无水乙醇与样品溶液吸光度值。

1.2.2.2 酸枣提取物对羟自由基清除能力的测定用蒸馏水配制质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸枣提取物样品和VC溶液。在反应体系中依次加入0.2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液和水杨酸-乙醇溶液，再加入不同质量浓度的样品溶液和VC溶液各0.2 mL，0.2 mL 6 mmol/L的双氧水溶液，于37 ℃反应1 h，反应完全后在波长510 nm处测定混合物的吸光度值[19]。

式中：A0为空白对照吸光度值，A1为样品吸光度值，A2为不加水杨酸-乙醇溶液的样品本底吸收。

1.2.2.3 酸枣提取物对Fe3+还原能力的测定 用蒸馏水配制质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的酸枣提取物样品和VC溶液。取不同质量浓度样品溶液和VC溶液各0.2 mL，分别加入pH6.6的磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液各1.0 mL，在50 ℃条件下反应20 min，冷却，加入10%三氯乙酸溶液0.8 mL，混匀，3000 r/min，离心5 min，取0.5 mL上清液，加入蒸馏水0.5 mL和0.1% FeCl3溶液0.1 mL，反应完全后在波长700 nm处测定混合物的吸光度值[20]。

1.2.3 酸枣提取物体内抗衰老活性的测定

1.2.3.1 果蝇的培养 果蝇饲养在温度（24±1）℃，相对湿度50%～60%，12 h明暗交替的环境中。基础培养基的配制[21]：称取蔗糖31 g、琼脂3 g，加入到300 mL三蒸水中，加热煮沸，再将42 g玉米粉加入到160 mL三蒸水中混匀后倒入煮沸的液体中，混合均匀，继续加热至混合溶液呈糊状后停止加热。室温条件下放凉至70 ℃左右时，加入3 g酵母粉，3 mL丙酸，搅拌均匀，趁热分装至洗净灭菌的培养指管中备用。含药培养基的配制：参照预实验结果，在制作基础培养基的过程中加入酸枣提取物0.55、2.73、5.45 g，分别折合药物质量分数为0.1%、0.5%、1.0%。给药组饲喂含药培养基，空白组饲喂基础培养基，培养基每5 d更换一次。

1.2.3.2 酸枣提取物对果蝇寿命的影响 收集刚羽化8 h内未交配的雌、雄果蝇共800只，随机分成4组，每组200只（雌雄各半），分别置于不同质量分数的酸枣提取物（0.1%、0.5%、1.0%）含药培养基和基础培养基中，每日固定时间观察记录死亡的果蝇数，直到全部果蝇死亡（非正常死亡的果蝇不纳入统计）。统计分析果蝇的平均寿命和最长寿命，最长寿命为每组最后10%果蝇的平均寿命，记录每管果蝇的存活时间，并绘制生存曲线[22]。

1.2.3.3 酸枣提取物对果蝇逆重力爬行能力的影响

收集刚羽化8 h内未交配的雌、雄果蝇共160只，随机分成4组，即不同质量分数酸枣提取物组（0.1%，0.5%，1.0%）与空白组，每组40只（雌雄各半）。在上述培养基中将果蝇分别培养至第10 d和第30 d时，进行果蝇逆重力爬行实验。将待测果蝇转移至测定管中，轻拍测定管使果蝇落在测定管底部，记录在10 s内爬升至8 cm的果蝇数，每组果蝇测5次，两次测量之间间隔1 min[23]，按公式计算果蝇攀爬指数，攀爬指数越高，代表果蝇逆重力爬行能力越强。

1.2.3.4 酸枣提取物对果蝇抗氧化能力的影响 收集刚羽化8 h内未交配的雌、雄果蝇共2400只，随机分成4组，即不同质量分数酸枣提取物组（0.1%，0.5%，1.0%）与空白组，每组600只（雌雄各半），分别培养于相应质量分数的含药培养基和基础培养基中，培养至第10 d和第30 d时，每组果蝇用二氧化碳气体麻醉300只（雌雄各半，25只/管），称重并放在装有液氮的研钵中研磨后，加入预冷的生理盐水制备2%的组织匀浆液。在4 ℃条件下，3000 r/min，离心10 min，取上清液用生化法测定SOD、CAT活力及MDA含量[24]。

1.3 数据处理

实验结果以均值±标准差（Mean±SD）表示。采用GraphPad Prism 8.0和 IBM SPSS 26.0作图和进行统计学处理，采用单因素方差分析，用LSD法进行两两比较，生存试验采用Log-rank检验分析寿命的显著性，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 酸枣提取物体外抗氧化活性实验结果

2.1.1 DPPH自由基清除能力 DPPH在有机溶剂中是一种稳定的脂质自由基，其乙醇溶液（或甲醇溶液）呈深紫色，当加入具有自由基清除能力的物质时，DPPH的孤对电子被配对，溶液由紫色逐渐褪变为黄色，而颜色褪变的程度与其接受电子的数量呈化学计量关系，因此可用于评价样品的抗氧化能力[18]。由图1可知，在0.05～1.00 mg/mL质量浓度范围内，酸枣提取物对DPPH自由基清除能力随着质量浓度的升高而逐渐增强，当质量浓度达到1.00 mg/mL时，其清除能力为74.17%，且呈继续上升的趋势。VC在0.05～0.20 mg/mL质量浓度范围内，其对DPPH自由基清除能力随着质量浓度的增加大幅增强，但当质量浓度超过0.20 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除能力趋于平缓，不再继续增强。当清除体系50%的DPPH自由基时，所需酸枣提取物的质量浓度为0.44 mg/mL，而VC为0.07 mg/mL。

图1 酸枣提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of extract from Ziziphus jujuba

2.1.2 羟自由基清除能力 过氧化氢与Fe2+反应可产生羟自由基，在反应体系中加入水杨酸可以与羟自由基反应产生紫色化合物，当加入具有羟自由基清除能力的样品时，可以使紫色化合物生成量减少，利用这一原理可以测定样品对羟自由基的清除能力[18]。由图2可知，在0.05～1.00 mg/mL质量浓度范围内，与DPPH自由基清除能力相似，酸枣提取物对羟自由基清除能力随着质量浓度的增加，羟自由基的清除能力逐渐增强，呈现良好的剂量依赖性。VC在0.05～0.60 mg/mL质量浓度范围内，其对羟自由基清除能力随着质量浓度的增加大幅增强，当质量浓度大于0.6 mg/mL时，其羟自由基清除能力不再增强。虽然酸枣提取物在各质量浓度下，羟自由基清除能力均较VC弱，但仍然具有很强的羟自由基清除效果。当清除体系50%的羟自由基时，所需酸枣提取物的质量浓度为1.40 mg/mL，而VC为0.19 mg/mL。

图2 酸枣提取物对羟自由基的清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of extract from Ziziphus jujuba

2.1.3 Fe3+还原能力 样品或VC作为还原剂可将铁氰化钾体系中的Fe3+还原成Fe2+，而后者可与显色剂反应生成蓝色化合物，将混合物置于700 nm波长下测定吸光度值，吸光度值越大，则样品还原力越强[25]。由图3可知，酸枣提取物对Fe3+还原能力随着质量浓度的增加，呈缓慢增强的趋势。VC在0.05～0.40 mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，其对Fe3+还原能力大幅增强，当质量浓度超过0.40 mg/mL时，其对Fe3+还原能力趋于平缓。DPPH自由基清除率、羟自由基清除率及Fe3+还原能力的测定是常用的评价物质体外抗氧化能力的方法，酚类、多糖[4]、黄酮类[9,26]化合物已被研究证实具有较好的清除自由基能力和还原能力，酸枣提取物中富含大量的酚类、多糖和黄酮类成分，这些成分可能是其发挥体外抗氧化作用的物质基础。

图3 酸枣提取物对Fe3+的还原能力Fig.3 Fe3+ reduction ability of extract from Ziziphus jujuba

2.2 酸枣提取物的体内抗衰老活性

2.2.1 酸枣提取物对果蝇寿命的影响 在明确酸枣提取物体外抗氧化活性的基础上，进一步利用果蝇进行酸枣提取物体内抗氧化活性研究。选择果蝇这一模式生物是因为果蝇的生命周期短、繁殖能力强、易于饲养、雌雄易分辨，且果蝇与人类有着十分相似的致病基因和衰老基因，因此果蝇在抗衰老药物活性筛选研究中占有重要的地位[27]。本研究通过制作含药培养基的方式，研究酸枣提取物对自然衰老果蝇寿命的影响，结果发现，酸枣提取物可以在一定程度上延长雌、雄果蝇的寿命。与雌性空白对照组相比，1.0%酸枣提取物组雌果蝇平均寿命由43.91 d延长至48.13 d（P<0.01），延长了9.61%；酸枣提取物各质量分数组雌果蝇的最长寿命均显著延长（P<0.05或P<0.01）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，与空白组雌果蝇相比，1%酸枣提取物组雌果蝇的寿命显著延长（P<0.01）。与雄性空白对照组相比，0.5%、1.0%酸枣提取物组雄果蝇的平均寿命分别由42.46 d延长至46.8、48.36 d（P<0.05或P<0.01），分别延长了10.23%、13.91%；酸枣提 取物各组雄果蝇的最长寿命均显著增加（P<0.01），且呈现出良好的剂量-效应关系。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，与空白组雄果蝇相比，0.5%与1%酸枣提取物组雄果蝇的寿命显著延长（P<0.05、P<0.01）。酸枣提取物延长果蝇寿命的作用可能与其富含的黄酮类[26]、酚类[28]成分有着密切的联系，实验结果见图4，表1。

图4 酸枣提取物对果蝇寿命曲线的影响Fig.4 Effect of Ziziphus jujuba extract on lifespan curves of D. melanogaster

表1 酸枣提取物对果蝇寿命的影响Table 1 Effect of Ziziphus jujuba extract on the lifespan of D. melanogaster

2.2.2 酸枣提取物对果蝇逆重力爬行能力的影响果蝇逆重力爬行实验是依据果蝇反趋地性行为的特点而设计的，攀爬指数可以从行为学角度反映其运动能力，随着果蝇日龄的增加，其运动能力也会随之降低[29]。由图5分析得出，在第10 d时，仅0.5%酸枣提取物组雄性果蝇攀爬指数增高（P<0.01），当用含药培养基饲喂至第30 d时，各不同质量分数酸枣提取物组雌、雄果蝇的攀爬指数均有不同程度的提高（P<0.05或P<0.01），酸枣提取物可以显著增强30日龄果蝇的攀爬能力，提示酸枣提取物可能对自然衰老果蝇的运动能力具有提升作用。

图5 酸枣提取物对果蝇逆重力爬行能力的影响Fig.5 Effect of Ziziphus jujuba extract on the negative geotaxis ability of D. melanogaster

2.2.3 酸枣提取物对果蝇体内抗氧化能力的影响

2.2.3.1 酸枣提取物对果蝇体内SOD活力的影响SOD是一种抗氧化酶，可以清除自由基[30]。不同质量分数酸枣提取物对雌、雄果蝇体内SOD活力的影响见图6。在第10 d，与空白组相比较，0.5%、1.0%酸枣提取物组雄果蝇及1.0%酸枣提取物组雌果蝇的SOD活力显著增强（P<0.05或P<0.01）；在第30 d，与空白组相比，1.0%酸枣提取物组雄果蝇及0.5%、1.0%酸枣提取物组雌果蝇SOD活力增强，经统计学分析，具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。第10 d和第30 d的0.1%酸枣提取物组雌、雄果蝇体内SOD活力与空白组相比较，有升高的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），提示给予酸枣提取物，可以增强雌、雄果蝇体内SOD活力，且呈现较好的剂量依赖性，但是在较低剂量时，对雌、雄果蝇体内SOD活力的影响较小。

图6 酸枣提取物对果蝇体内SOD活力的影响Fig.6 Effect of Ziziphus jujuba extract on SOD activity in D. melanogaster

2.2.3.2 酸枣提取物对果蝇体内MDA含量的影响MDA是脂质发生过氧化反应产生的代谢产物，可作为机体脂质过氧化程度的指标，其含量可间接反映细胞损伤程度[31]。不同质量分数酸枣提取物对雌、雄果蝇体内MDA含量的影响见图7。在第10 d，与空白组相比较，1.0%酸枣提取物组的雌、雄果蝇体内的MDA含量均显著降低（P<0.05）。在第30 d，与空白组相比较，0.5%、1.0%酸枣提取物组雄果蝇与三个剂量酸枣提取物组雌果蝇体内的MDA含量显著降低（P<0.05或P<0.01），且30 d各组雌、雄果蝇的MDA含量均高于10 d组，说明MDA的含量会随着果蝇日龄的增加而增加，不同质量分数的酸枣提取物可以降低雌、雄果蝇体内MDA的含量。

图7 酸枣提取物对果蝇体内MDA含量的影响Fig.7 Effect of Ziziphus jujuba extract on MDA content in D. melanogaster

2.2.3.3 酸枣提取物对果蝇体内CAT活力的影响CAT是体内另一种抗氧化酶，与SOD作用相似，均可清除体内自由基，从而减少机体产生的过氧化物[31]。不同质量分数酸枣提取物对雌、雄果蝇体内CAT活力的影响见图8。在第10 d，与空白组相比较，0.5%与1.0%酸枣提取物组雌果蝇体内的CAT活力显著增强（P<0.05），各质量分数组雄果蝇体内CAT活力未见明显改变（P>0.05），提示酸枣提取物对较低日龄的雄果蝇体内CAT活力影响较小。在第30 d，与空白组相比较，0.1%、1.0%酸枣提取物组雄果蝇与0.5%酸枣提取物组雌果蝇体内的CAT活力显著增强（P<0.05），说明不同质量分数的酸枣提取物能够提高果蝇体内CAT活力。

图8 酸枣提取物对果蝇体内CAT活力的影响Fig.8 Effect of Ziziphus jujuba extract on CAT activity in D. melanogaster

3 结论

本研究采用了DPPH自由基清除率、羟自由基清除率及Fe3+还原能力的方法评价了酸枣提取物的体外抗氧化活性，结果表明，不同质量浓度的酸枣提取物对DPPH自由基、羟自由基均有不同程度的清除作用，对Fe3+具有还原能力，且呈现良好的剂量依赖性。在此基础上，利用果蝇这一模式生物，通过制作含药培养基的方式，探索了酸枣提取物对自然衰老果蝇寿命的影响，发现酸枣提取物可以在一定程度上延长雌、雄果蝇的平均寿命和最长寿命，说明酸枣提取物具有一定的抗衰老作用。酸枣提取物还可以显著增强30日龄果蝇的攀爬能力，提示酸枣提取物可能对自然衰老果蝇的运动能力具有提升作用。此外，酸枣提取物不同质量分数组果蝇SOD、CAT活力均有不同程度的升高，MDA含量降低，说明酸枣提取物对果蝇有一定的抗氧化效果。综上所述，酸枣提取物具有较好的体内外抗氧化能力和潜在抗衰老作用，其作用机制可能与提高抗氧化酶活性及抑制脂质过氧化物的产生有关，该研究结果为酸枣提取物开发成为延缓衰老的中药保健食品提供实验依据。