王 雪，李 乾，刘彩红，古丽丹·塔勒达吾，刘凤兰，冯作山，王 静,

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆果品采后科学与技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆林业科学院经济林研究所，新疆 乌鲁木齐 830063）

枸杞（Lycium barbarumL.）属于茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium Linn.），是多年生双子叶落叶灌木[1−2]。目前，我国是全球枸杞产品生产和消费的最主要地区[3]。枸杞含有多种活性物质，具有降血糖、抗衰老、增强免疫力、保护细胞等作用，是药食两用的进补佳品[4−5]。但是由于采后的枸杞仍然进行着正常的以呼吸为主导的新陈代谢活动，在果实成熟至衰老的生命历程中呼吸速率不断变化并出现呼吸高峰[6]，因此采后枸杞的贮藏品质、抗病性等受到不同程度的影响[7]。有研究称采后枸杞鲜果常温下放置2～3 d便开始出现衰老软化现象，导致果实品质降低[8]。因此找到一个经济有效的延长枸杞鲜果贮藏期，提高贮藏品质的保鲜方法显得尤为重要。

目前关于枸杞鲜果保鲜的研究报道主要集中于水杨酸处理[9]、水杨酸结合气调处理[10]、壳聚糖涂膜处理[11−13]及保鲜膜处理[14]等，但采用NO熏蒸枸杞鲜果保鲜的研究报道尚不多见。NO是一种小分子气体，适宜浓度的NO具有延缓果蔬组织成熟衰老、减轻冷害症状和控制采后病害等作用，近年来已广泛应用于芒果、李、甜瓜、莲雾、桃、草莓等果蔬保鲜中。有研究报道，NO处理采后果蔬能较好地维持其硬度，保持果蔬较好的贮藏品质[15−17]。另有研究显示，NO熏蒸处理有效维持甜瓜果实采后硬度、减缓可溶性果胶质量分数的上升，降低多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、纤维素酶的活力[18]。NO处理延缓贮藏过程中的采后枇杷[19]、莲雾[20]、草莓[21]和番木瓜[22]细胞壁解聚进程，抑制果实细胞壁代谢相关酶活力，减慢原果胶和半纤维素分解速率，对保持果实的品质产生积极作用。但NO熏蒸枸杞鲜果对细胞壁代谢影响的研究尚未见相关报道。

因此本试验选用产自新疆博乐市的“宁杞七号”枸杞鲜果为试材，采用300 μL/L的外源NO气体熏蒸枸杞，探究经NO熏蒸枸杞鲜果软化与细胞壁的关系，以期为外源NO熏蒸在抑制枸杞鲜果软化方面的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“宁杞七号”枸杞 2019年7月3日采摘自新疆博乐市精河县托里乡，带果柄和萼片采摘，在当地3±0.5 ℃冷库中预冷24 h，装框运送至新疆农业大学3±0.5 ℃冷库，挑选无腐烂、发霉及遭受机械损伤的枸杞鲜果16 kg作为试验原料（处理和对照各8 kg）；3,5-二硝基水杨酸 上海科峰实验有限公司；结晶酚

天津市风船化学试剂科技有限公司；亚硫酸钠、p-硝基苯酚 天津市致远化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠 天津市光复精细化工研究所；一水合柠檬酸、二水合柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司；水杨苷 上海素培生物科技中心；碳酸钠 天津市北联精细化学品开发有限公司；p-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷 索莱宝公司；咔唑 上海化学试剂有限公司；无水乙醇 天津市鑫铂特化工有限公司；所有试剂均为分析纯。

D3024R冷冻离心机 上海珂淮仪器有限公司；PTT-A+200电子天平 福州华志科学仪器有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅、FL-1可调式封闭电炉 北京市永光明医疗仪器有限公司；752 N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；TA.XT Plus质构仪 英国SMS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞鲜果的处理方法 样品处理前一晚使用酒精对熏蒸罐进行密闭消毒12 h，并于熏蒸前4 h打开熏蒸罐散去酒精气味。待酒精气味散去之后进行抽真空处理，在体积为26 L的熏蒸罐内注入NO纯度为99.9%的标准气体，使用300 μL/L NO室温熏蒸3 h，每罐处理枸杞鲜果2 kg。处理后的枸杞使用带孔塑料筐盛装，每框约2 kg（不超过塑料筐的三分之一），并在上方覆盖报纸，立即放置3 ℃低温冷库进行贮藏，每6 d取样一次，共取7次样。

1.2.2 腐烂率的测定 采用观察法，当果实表面发生腐烂或有肉眼可见的腐烂菌斑即视为腐烂果。随机取100枚枸杞鲜果，数出所有发霉腐烂果实个数，计算腐烂率。

1.2.3 硬度的测定 随机取50枚果实，使用TA.XT plus质构仪测定枸杞硬度。测试方法：去果实赤道部相对两面的皮，全质构分析TPA；探头：P/36 R柱形探头；测试目标模式：应变；压缩程度：70%；测前速：2 mm/s；测中速：1 mm/s；测后速：1 mm/s；单位：N。

1.2.4 果胶物质含量的测定 采用咔唑比色法[23]测定果胶物质含量，内容稍作改动。将20 g枸杞鲜果打浆，从中称取1 g直接倒入10 mL离心管中，添加95%乙醇约至离心管8 mL处，将其放于沸水浴中加热1 h，同时在加热过程中及时补加95%乙醇。取出冷却至室温，于25 ℃、8000 r/min条件下离心30 min，留沉淀，加95%乙醇约离心管8 mL处，以上步骤重复4次。然后将沉淀放入原试管中，加入20 mL蒸馏水，在50 ℃水浴中保温30 min，以溶解果胶。取出冷却至室温后，将上清液移入100 mL容量瓶中，用少量水洗涤沉淀，离心后，一并将上清液移入到容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液即为可溶性果胶。

经蒸馏水洗涤后的沉淀物，仍保留在原刻度离心管中，再向离心管中加入0.5 mol/L硫酸溶液5 mL，沸水浴中加热1 h以水解原果胶。取出冷却至室温后，25 ℃、8000 r/min条件下离心15 min。上清液倒入100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，此为原果胶测定液。

取25 mL刻度试管，加入1 mL原果胶提取液/1 mL可溶性果胶提取液（称取10.5 g NaCl，用50 mmol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，稀释至100 mL，摇匀）和6 mL浓硫酸，沸水浴20 min，冷却至室温，加入0.2 mL咔唑乙醇溶液（1.5 g/L）（称取0.15 g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100 mL），暗处反应30 min，于530 nm处测定反应液吸光度值。

式中，m′—从标准曲线（y=0.0028X-0.0009）查得的半乳糖醛酸质量，μg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；m—样品质量，g。

1.2.5 多聚半乳糖醛酸酶活力的测定 采用比色法[23]测定多聚半乳糖醛酸酶（PG）活力，内容稍作改动。将20 g枸杞鲜果打浆，从中称取10 g与95%的预冷乙醇一起加入离心管中，摇匀，低温静置。10 min后离心20 min（12000 r/min、4 ℃），留沉淀，加入80%预冷的乙醇，重复上述操作。留沉淀加入8 mL提取缓冲液，4 ℃条件下静置20 min，离心，上清液为PG提取液。

剩余步骤严格按照曹建康PG活力测定进行。

式中，m′—从标准曲线（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖质量，mg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g；1.08—葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数（194/180）。

1.2.6β-半乳糖苷酶活力的测定 采用曹建康等[23]的测定方法测定β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力。取0.5 mL p-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷溶液（5 mmol/L）和0.5 mL酶提取液于试管中，在37 ℃水浴中保温30 min。取出后立即向试管中加入2 mL碳酸钠溶液（1 mol/L）以终止酶促反应，充分摇匀冷却，于波长400nm处测定混合液的吸光值。

式中，m′—从标准曲线（y=0.18X+0.0114）查得的p-硝基苯酚物质的量，μmol；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g。

1.2.7 纤维素酶活力的测定 采用曹建康等[23]的测定方法测定纤维素酶（Cx）活力。两支25 mL试管中均加入1.5 mL羧甲基纤维素钠溶液（10 g/L）和0.5 mL酶提取液，但其中一支试管中的酶提取液须经过沸水煮5 min处理。恒温水浴（37 ℃）1 h后直接加入3,5-二硝基水杨酸1.5 mL，沸水煮5 min，冷水中快速冷却至室温，加蒸馏水至25 mL处。540 nm处测定前充分摇匀。

式中，m′—从标准曲线（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖质量，mg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g。

1.2.8β-葡萄糖苷酶活力的测定 采用水杨苷水解法[23]测定β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力，内容稍作改动。将20 g枸杞鲜果打浆，从中称取10 g与95%的预冷乙醇一起加入离心管中，充分摇匀，低温放置10 min，然后在4 ℃、12000 r/min条件下离心20 min。留沉淀，加入10 mL提前预冷的80%乙醇，振荡，低温放置10 min，4 ℃、12000 r/min条件下离心20 min。留沉淀，加入5 mL提前预冷的缓冲液，低温放置20 min，同等条件下离心20 min，收集上清液，4 ℃保存备用。

取1.5 mL水杨苷溶液（10 g/L）和0.5 mL酶提取液于25 mL具塞刻度试管中，在37 ℃水浴中保温1 h。取出后，立即向试管中加人1.5 mL DNS试剂以终止酶促反应，充分摇匀。然后在沸水浴中煮沸5 min，取出冷却后，用蒸馏水稀释至25 mL，充分混匀，在波长540 nm处测定。

式中，m′—从标准曲线（y=0.5075X+0.0046）查得的葡萄糖质量，mg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；t—酶促反应时间，h；m—样品质量，g。

1.3 数据处理

以上试验均设定3个重复。试验数据由Excel 2010进行整理，SPSS 19.0对试验数据进行分析，P<0.05、P<0.01分别表示差异显著、极显著，并用Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果腐烂率的影响

如图1所示，在贮藏期间，果实的腐烂率呈上升趋势，对照组和处理组果实分别在第12 d 和24 d开始出现明显腐烂，且NO处理组的腐烂率极显著（P<0.01）低于对照组，贮藏第36 d时对照组和NO处理组腐烂率分别为84.0%和38.0%，对照组腐烂率是NO处理组的2.21倍。说明NO熏蒸可以延缓果实腐烂的发生，后期可以抑制腐烂率的上升。

图1 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果腐烂率的影响Fig.1 Effect of NO fumigation on rotting rate of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.2 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果硬度的影响

枸杞果实硬度下降通常表现为口感发粘，果实从坚挺状态变为松散状态，导致软化。软化程度较高必然引起微生物侵染，造成腐烂。由图2可知，贮藏0～6 d，两组的枸杞硬度均呈现急速下降趋势，其中对照组果实硬度下降速度较快；贮藏6～36 d，对照组果实硬度快速下降，NO处理组呈现小幅度波动且在第36 d极显著（P<0.01）上升，究其原因可能是因为纤维素对细胞壁骨架起到了重要的支撑作用，延缓了果实软化；但自贮藏开始至结束，NO处理组硬度一直高于对照组枸杞，处理组和对照组枸杞硬度较起始点分别下降0.3 N和5.2 N，同时处理组的腐烂率极显著（P<0.01）低于对照组，该结论与郭芹等[24]研究结果相似。说明NO熏蒸可以显著抑制贮藏期间枸杞鲜果硬度下降，降低腐烂。

图2 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果硬度的影响Fig.2 Effect of NO fumigation on firmness of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3 NO处理对冷藏枸杞鲜果细胞壁代谢的影响

2.3.1 果胶物质含量

2.3.1.1 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果原果胶含量的影响 果胶类物质存在于胞间，起粘合联结作用，果实成熟软化时发生明显变化，其结构改变也是导致果实硬度发生变化的主要原因[25−27]，原果胶为非水溶性物质，含量越高，果实越坚挺。由图3可知，在整个贮藏过程中，对照组枸杞原果胶含量大致呈先上升后下降趋势，贮藏36 d原果胶含量较第0 d低8.99%；与对照组相比，NO处理组枸杞原果胶含量变化幅度较小，且处理组枸杞原果胶含量始终高于对照组；贮藏第6 d，处理组枸杞原果胶含量达到最高值；6～12 d，原果胶含量有所下降；12～36 d，原果胶含量基本没有变化；贮藏第36 d原果胶含量仅仅比贮藏第12 d低8.77%，较贮藏第0 d高18.77%。由此说明，NO熏蒸可有效保持冷藏枸杞鲜果原果胶含量，防止果实软化。

图3 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果原果胶含量的影响Fig.3 Effect of NO fumigation on the content of protopectin of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.1.2 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果可溶性果胶含量的影响 细胞壁中可溶性果胶为水溶性物质，其含量上升是果实软化的主要原因之一[28]。由图4可知，整个贮藏过程中对照组枸杞中可溶性果胶含量一直高于处理组；在贮藏第36 d效果极显著（P<0.01），且处理组枸杞可溶性果胶含量比对照组低51.3%，究其原因可能是NO气体熏蒸可抑制枸杞果实细胞壁中原果胶的降解，延缓可溶性果胶的生成，从而维持果实细胞壁结构完整性，延缓果实硬度下降速度，这与NO抑制木瓜软化结论相似[22]。由此说明，NO熏蒸可以抑制枸杞中可溶性果胶含量上升速率，维持枸杞鲜果贮藏过程中的质地。

图4 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果可溶性果胶含量的影响Fig.4 Effect of NO fumigation on soluble pectin content of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2 细胞壁代谢相关酶

2.3.2.1 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果多聚半乳糖醛酸酶（PG）活力的影响 果胶类物质中的原果胶向可溶性果胶的转化速度与果胶酶类活性密不可分。由图5可知，贮藏0～36 d，两组枸杞鲜果PG活力均大致呈下降趋势，且处理组枸杞PG活力始终低于对照组。贮藏0～12 d，对照组与处理组鲜果PG活力迅速下降，第12 d时分别比贮藏第0 d时低43.37%和45.80%。自12 d至贮藏结束，两组枸杞鲜果均在贮藏第18 d和30 d出现酶活力高峰，且对照组分别高于处理组8.2%（P>0.05）和26.94%（P<0.01）。贮藏第30 d，两组枸杞均出现酶活力高峰，其中对照组PG活力极显著高于处理组（P<0.01），同期对照组原果胶含量出现较低值，并极显著低于处理组（P<0.01）（图3）；说明NO处理可能通过降低果实PG基因的表达[29]，抑制冷藏枸杞鲜果PG活力上升，缓解果实中原果胶向可溶性果胶的转化速率，降低腐烂。

图5 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果PG活力的影响Fig.5 Effect of NO fumigation on PG activity of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.2 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力的影响β-Gal可以使果胶降解或溶解，由图6可知，在整个贮藏过程中，两组枸杞鲜果的β-Gal活力大致呈下降趋势，且处理组β-Gal活力始终低于对照组。贮藏18～36 d，处理组枸杞鲜果β-Gal活力低于对照组，且后期表现更加明显。贮藏结束时，处理组β-Gal活力极显著低于对照组（P<0.01），该现象与果实原果胶和可溶性果胶变化趋势相对应（图3～图4）。表明NO熏蒸降低了β-Gal活力，抑制原果胶物质的转化速度，缓解细胞壁结构发生变化，对降低腐烂有一定的作用。

图6 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果β-Gal活力的影响Fig.6 Effect of NO fumigation on the activity of β-gal of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.3 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果纤维素酶（Cx）活力的影响 果蔬采后硬度下降导致软化现象主要与其品种、呼吸强度、细胞壁代谢、糖代谢等多种因素相关[29−33]。有研究报道，细胞壁总体结构的改变是果实软化的重要原因之一[34]。细胞壁是一种“纤维素-半纤维素-果胶”组成的稳定结构[22]。纤维素对细胞壁骨架起到了重要地支撑作用，纤维素结构变化导致植物细胞壁变薄，硬度下降，果实软化[35−37]。Cx可降解细胞壁中的纤维素，破坏细胞壁结构。由图7可知，对照组与处理组枸杞Cx活力变化趋势基本一致，呈现“降-升-降-升”的趋势。其中贮藏12～36 d处理组Cx显著低于对照组（除24 d之外）。两组枸杞Cx酶活力均在第18 d达到高峰，且对照组酶活力显著高于处理组（P<0.05）；贮藏18～36 d，两组鲜果酶活力先快速下降又迅速升高，在贮藏末期（30～36 d）对照组枸杞Cx活力极显著高于处理组（P<0.01），与朱树华使用NO处理草莓结果相似[38]，可能是因为NO通过影响Cx的pH，从而引起Cx构象和和生理功能发生改变[39]。由此说明，NO熏蒸对于抑制冷藏枸杞鲜果Cx活力上升具有一定效果。

图7 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果Cx活力的影响Fig.7 Effect of NO fumigation on Cx activity of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

2.3.2.4 NO熏蒸处理对冷藏枸杞鲜果β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力的影响β-Glu属于纤维素酶类，对果实细胞壁的降解与稳定产生重要影响[23−24]。Cx和β-Glu参与细胞壁中纤维素糖化，最终将纤维素水解成葡萄糖，细胞壁结构瓦解，果实软化，腐烂发生。由图8可知，对照组枸杞鲜果呈先上升后下降的趋势，其中在藏第30 d出现活力高峰。相较于对照组，处理组酶β-Glu活力上升趋势更缓慢，且在第12、18和30 d显著低于对照（P<0.05）。说明，NO熏蒸在不同贮藏时期抑制β-Glu活力的上升作用表现不同。

图8 NO熏蒸对冷藏枸杞鲜果β-Glu活力的影响Fig.8 Effect of NO fumigation on the activity of β-Glu of postharvest of Lycium barbarum fruit during cold storage

3 结论

本试验研究结果表明，在3±0.5 ℃的贮藏条件下，外源NO熏蒸处理可通过抑制枸杞鲜果PG、β-Glu、β-Gal和Cx活力，维持较高的原果胶含量，保持果实细胞壁结构完整性，显著（P<0.05）延缓了硬度的下降，抑制果实腐烂率的上升。说明NO熏蒸在抑制果实细胞壁代谢相关酶活力，保持果实品质，延缓果实成熟软化方面发挥着重要的作用。本研究结果将为外源NO熏蒸在枸杞鲜果保鲜方面的应用提供理论参考。