冼丽清，李 珊 ，冯 彬，梁 俭，刘晓凤

（1.桂西区域生态环境分析和污染控制重点实验室，广西 百色 533000；2.百色学院材料科学与工程学院，广西 百色 533000；3.百色学院化学与环境工程学院，广西 百色 533000）

茶叶中含有丰富的生物活性物质，如黄酮[1]、多酚[2]、生物碱[3]、茶多糖等。其中，茶多糖是一种包含单糖链、蛋白质及矿物质元素等物质的复合物[4]。医学及生理学试验证实，茶多糖具有广泛的生理活性，如抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、降血脂、降血压、抑菌消炎、调节机体免疫力等[5]，尤其在治疗糖尿病方面具有特殊的疗效[6]。茶多糖已被认定为茶叶中茶多酚之外的另一极具开发价值的天然产物。凌云白毫为百色凌云、乐业地区特产的乔木类大叶茶种，因芽、叶被满白色绒毛而得名，为当地脱贫攻坚的关键经济作物[7]。受限于当地不发达的地方经济，凌云白毫作为当地的名片产品，其生物活性物质如茶多糖的含量及性质研究尚未系统开展，导致评估凌云白毫的生理功能缺乏具体数据支撑，推广乏力。

热水浸提法是提取多糖类物质的常用方法，可最大程度地保留其物质结构及生物活性的完整性，但也存在耗时长、提取效率低等缺点。为提高提取效率，酶解提取、微波辅助提取、超临界萃取提取、亚临界水萃取提取、超声波辅助提取等提取方法相继被发展出来[8]。各种提取方法中，酶解提取受限条件多，酶的活性难以完全发挥，微波辅助提取产生的瞬时高温对产物的生物活性有较大影响，超临界萃取提取、亚临界水萃取提取需要使用专门的设备，成本高昂。超声波辅助提取则主要通过超声波的机械效应、空化效应及热效应提高小分子物质在介质中的穿透能力，提高其得率的同时对分子结构的破坏性较小，并且操作简便[9]。刘小辰等[10]比较了热水浸提、酸辅助提取、碱辅助提取、酶解提取、高压热水浸提、超声波辅助热水浸提等6种方法对香蕉皮粗多糖提取率的影响，结果显示超声波辅助热水浸提法提取物中多糖含量最高。此外，超声波也经常联用其它技术用于植物活性成分的提取以期发挥更加优越的提取性能[11]。

因此，本文采用超声波辅助热水浸提法提取凌云白毫中的茶多糖，优化提取工艺，并初步探讨多糖类物质的抗氧化效果，填补凌云白毫中茶多糖提取工艺及生物活性研究的空白，并依据所得数据评估茶多糖的含量及其对机体的保健效果，推动凌云白毫在国内的深入推广。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凌云白毫 有机绿茶，广西浪伏茶业有限公司；玉米油 鲁花玉米胚芽油（物理压榨，单烯脂肪酸+多烯脂肪酸>85%），购于百色市盛辉超市；葡萄糖、苯酚、30%过氧化氢、抗坏血酸（VC）、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH自由基） 均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

BSA123-CW电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；820DP高功率数控超声波清洗器 深圳市光点超声波设备有限公司；UV-27000岛津紫外可见分光光度计 岛津企业管理（中国）有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器 常州市亿能实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 凌云白毫中茶多糖的提取 市售凌云白毫50 g，60 ℃干燥至恒重（前后质量差<0.01 g），粉碎，过筛（d=0.42 mm），得茶粉原料。称取1.000 g茶粉原料，按比例混合纯水，在设定的提取温度、超声时间、超声功率等条件下进行提取，反复2次，合并提取液。Sevage法除蛋白，体系浓缩至50 mL，过滤。滤液转移至100 mL容量瓶中，纯水定容，即为多糖提取液[12]。

1.2.2 单因素实验 称取1.000 g茶粉原料，固定基准提取条件：液料比60:1 mL/g、提取温度50 ℃、超声时间 20 min、超声功率150 W[13]。在上述基准提取条件下开展单因素实验，依次考察液料比（50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 mL/g）、提取温度（40、50、60、70、80 ℃）、超声时间（10、15、20、25、30 min）及超声功率（100、150、200、250、300 W）等因素对茶多糖提取效果的影响。

1.2.3 Box-Bohnken法优化茶多糖提取工艺 依据单因素实验所得结果，选取其中的显著因素为自变量，茶多糖得率为响应值，利用响应面法中的Box-Bohnken法优化各因素的水平组合[14−15]，因素水平表如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 葡萄糖标准品回归方程的建立及茶多糖得率的计算 移取浓度为0.1000 mg/mL葡萄糖标准品溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL至具塞试管中，加纯水稀释至2.00 mL。振荡过程中，添加5.0%苯酚水溶液1.00 mL、浓硫酸 5.00 mL（分批加入），50 ℃恒温振荡10 min，在489 nm处测定体系吸光度A[16]。以吸光度A对葡萄糖标准品溶液浓度c进行线性回归，得葡萄糖标准品回归方程：A=17.61c+0.0899，R2=0.9980。按上述方法测定多糖提取液吸光度Aa，带入葡萄糖标准品回归方程求得多糖浓度ca，按下式计算茶多糖得率：

式中：ca为经计算所得茶多糖浓度， mg/mL；D为茶多糖稀释倍数；V为茶多糖提取液体积， mL；m为茶粉原料质量，mg。

1.2.5 茶多糖的纯化及体外抗氧化效果测定

1.2.5.1 茶多糖的纯化 混合多批次茶多糖提取液，浓缩至100 mL，过滤。滤液混合4倍量无水乙醇并于4 ℃冷藏24 h，可见容器底部有白色丝状沉淀。抽滤，固体用丙酮-纯水反复冲洗至洗液无色。固体用少量水溶解，DEAE纤维素-52柱层析纯化（层析柱1.5 cm×25 cm；纯水为洗脱剂，5 mL/min）。洗脱液浓缩，快速冷冻，减压抽干得灰白色固体，即为茶多糖测试品[17]。称取一定量测试品茶多糖，配制浓度分别为0.2、0.3、0.5、0.8、1.2 mg/mL茶多糖待测液。

1.2.5.2 茶多糖对羟基自由基（·OH）清除效果的测定

取5支洁净试管，分别加入不同浓度多糖待测液2.00 mL，8.000 mmol/L硫酸亚铁溶液2.00 mL、1.0%过氧化氢溶液2.00 mL。振荡均匀后，继续加入7.000 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2.00 mL。上述5个反应体系25 ℃继续振荡60 min，于510 nm处测定体系吸光度Ax1[18−19]，按下式计算茶多糖对·OH的清除率：

式中：Ax1为标准测试组测定体系吸光度；Ap1为对照组（以纯水取代过氧化氢溶液）测定体系吸光度；A01为空白组（以纯水取代多糖待测液）测定体系吸光度。

1.2.5.3 茶多糖对DPPH·清除效果的测定 取5支洁净试管，分别加入不同浓度多糖待测液2.00 mL、0.2000 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.00 mL。上述5个反应体系置于黑暗环境中25 ℃振荡30 min，于517 nm处测定体系吸光度Ax2[20−21]，按下式计算茶多糖对DPPH自由基的清除率：

式中：Ax2为标准测试组测定体系吸光度；Ap2为对照组（以无水乙醇取代DPPH-乙醇溶液）测定体系吸光度；A02为空白组（以纯水取代多糖待测液）测定体系吸光度。

1.2.5.4 茶多糖对油脂（玉米油为例）的抗氧化效果的测定 称取一定质量的纯品茶多糖，混合至玉米油中，使茶多糖在测试样品中的质量分数分别为0、0.02%、0.05%。以Schall烘箱法[22]考察茶多糖对玉米油的抗氧化效果，每隔2 d取样一次并按照国标GB 5009.227-2016[23]中的滴定法测定油体样品中的过氧化值（POV）。VC作为对照，根据POV值的波动幅度衡量茶多糖对油脂的抗氧化效果。

1.3 数据处理

本文利用origin 9.0软件对数据作图处理；利用SPSS 17.0进行单因素方差分析（P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著）及IC50的计算；利用Design-Expert 8.5 软件中的Box-Bohnken法优化试验方案并处理数据。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对茶多糖提取效果的影响 图1展示，当液料比<60:1 mL/g时，茶多糖得率随液料比的增加而迅速升高。当液料比>60:1 mL/g时，茶多糖得率略微升高后处于平衡状态。提高溶剂用量可增大体系扩散压并促进茶多糖的溶出。当茶多糖完全溶出或浓度达到平衡时，得率不再发生显著变化（P>0.05），而过高的溶剂用量将增加体系的杂质含量及提取成本[24]。所得数据经单因素方差分析得P=0.032<0.05，差异性显著，表明考察范围内液料比对茶多糖提取具有显著的影响效果，并选用液料比50:1、60:1、70:1 mL/g进行后续优化试验。

图1 液料比对茶多糖提取效果的影响Fig.1 The effect of liquid-material ratio on extraction of tea polysaccharides

2.1.2 提取温度对茶多糖提取效果的影响 图2展示，当提取温度<60 ℃时，茶多糖得率随体系温度的升高而升高，当体系温度为60 ℃时的峰值3.72%。继续提高体系温度，茶多糖得率显著下降（P<0.05）。茶多糖分子的运动活性随体系温度的升高而增强，但长时间在高温环境中多糖的分子结构易降解并失去生物活性，得率下降[25]。所得数据经单因素方差分析得P=0.007<0.01，差异性极显著，表明考察范围内提取温度对茶多糖提取具有极显著的影响效果，并选用提取温度50、60、70 ℃进行后续优化试验。

图2 提取温度对茶多糖提取效果的影响Fig.2 The effect of temperature on extraction of tea polysaccharides

2.1.3 超声时间对茶多糖提取效果的影响 如图3所示，当超声时间<25 min时，茶多糖得率随超声时间的延长而升高，但增速逐渐减慢，当超声时间为25 min时的峰值3.17%。继续延长超声时间，茶多糖得率下降。延长超声时间可使植物细胞壁被超声波充分破碎，但多糖的分子结构长时间在超声波机械震荡作用下易被破坏，得率下降[26]。所得数据经单因素方差分析得P=0.044<0.05，差异性显著，表明考察范围内超声时间对茶多糖提取具有显著的影响效果，并选用超声时间15、20、25 min进行后续优化试验。

图3 超声时间对茶多糖提取效果的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction of tea polysaccharides

2.1.4 超声功率对茶多糖提取效果的影响 如图4所示，当超声功率<200 W时，茶多糖得率随超声功率的增加而升高，当超声功率为200 W时的峰值3.42%。继续增加超声功率，茶多糖得率下降。超声波通过机械作用破碎植物细胞壁，加速多糖的溶出。过高的超声功率将引发体系较为剧烈的空化作用，致使多糖分子失活降解，得率下降[27]。所得数据经单因素方差分析得P=0.027<0.05，差异性显著，表明考察范围内超声功率对茶多糖提取具有显著的影响效果，并选用超声功率150、200、250 W进行后续优化试验。

图4 超声功率对茶多糖提取效果的影响Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction of tea polysaccharides

2.2 Box-Bohnken法优化茶多糖提取工艺

2.2.1 Box-Bohnken法优化提取试验方案 各考察因素A液料比（mL/g）、B提取温度（℃）、C超声时间（min）及D超声功率（W）为自变量，茶多糖得率（%）为响应值，利用Box-Bohnken法优化提取试验方案，确定29个试验点。试验方案及结果如表2所示。

表2 Box-Bohnken法建立提取试验方案Table 2 Extraction scheme designed by Box-Bohnken method

2.2.2 回归方程的建立及显著性检验 以Box-Bohnken法对表2所得数据进行分析，获得茶多糖得率（%）与各考察因素：液料比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）及超声功率（D）的回归方程：

茶多糖得率（%）=−47.64867+0.83778A+0.73370B+0.47527C−4.90000×10−4D−4.87500×10−3AB+1.15000×10−3AC+1.05000×10−4AD+1.50000×10−3BC+2.65000×10−4BD+5.90000×10−4CD−4.56833×10−3A2−4.58083×10−3B2−0.017823C2−9.17333×10−5D2

采用方差分析法对所得回归方程进行显著性检验[28−29]，结果见表3。该方程P<0.0001，极显著；失拟项P=0.0992>0.05，不显著，说明所得方程可良好匹配试验操作。决定系数R2=0.9622，调整决定系数RAdj2=0.9244，说明因素选取合理，误差主要由随机误差产生并且可控，所得回归方程可用于试验预测茶多糖得率随因素、水平变化的趋势及幅度。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

回归方程一次项液料比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）及超声功率（D）对茶多糖得率的影响均极显著（P<0.01），根据F值大小，可知其显著性顺序为液料比>提取温度>超声时间>超声功率。交互项中交互作用AB的影响效果为极显著水平（P<0.0001），其它交互作用的影响不显著（P>0.05）。二次项A2、B2、C2、D2的影响均极显著，其显著性顺序为B2≈A2>C2>>D2。

2.2.3 交互作用的响应面分析 如图5所示，交互作用的显著程度与响应面的曲面曲率、等高线中心椭圆率成正比[30]。交互作用AB可见一显著的下滑曲面，且中心椭圆率最高。其它交互作用各方向曲面下滑平缓，等高线中心椭圆率较低甚至偏圆形。以上结果说明交互作用AB的影响效果显著高于其它交互作用，此结果与方差分析结果一致。

图5 交互作用AB对茶多糖提取效果的影响Fig.5 The effect of interactive AB on extraction of tea polysaccharides

2.2.4 最佳提取工艺的获取及稳定性验证 对回归方程进行最优化处理，获得茶多糖提取工艺的最佳条件：液料比68.51:1 mL/g、提取温度52.19 ℃、超声时间20.70 min、超声功率178.46 W，茶多糖得率可达5.06%。根据试验操作可达水平，将上述条件调整为：液料比69:1 mL/g、提取温度52 ℃、超声时间21 min、超声功率180 W。在此条件下，平行实验5次，实测茶多糖平均得率为（4.84%±0.04%），与模型预测值相近（<5%），说明该条件具有良好的稳定性，可用于茶多糖的提取。此外，根据茶多糖得率可知凌云白毫茶多糖含量较为丰富，高于国内著名绿茶品牌西湖龙井（3.10%）及信阳毛尖（1.84%）[31]。

2.3 茶多糖体外抗氧化效果

2.3.1 茶多糖对·OH的清除效果 如图6所示，凌云白毫茶多糖对·OH具有良好的清除效果，其清除能力随茶多糖浓度的升高而增强，并且高浓度条件下有进一步增强的趋势。当茶多糖浓度为1.2 mg/mL时，对·OH的清除率为82%。经SPSS17.0软件分析，凌云白毫茶多糖清除·OH的IC50为0.262 mg/mL，低于VC（IC50=0.027 mg/mL）对·OH的清除能力。

图6 茶多糖对·OH的清除效果Fig.6 The clearance effect of tea polysaccharides on ·OH

2.3.2 茶多糖对DPPH·的清除效果 如图7所示，茶多糖对DPPH·具有较强的清除效果，其清除能力随茶多糖浓度的增加而逐渐增强，但增速减慢并趋近平衡。当茶多糖浓度为1.2 mg/mL时，对DPPH·的清除率为69%。经SPSS 17.0软件分析，凌云白毫茶多糖清除DPPH·的IC50为0.438 mg/mL[32]，明显低于VC（IC50=0.072）对DPPH·的清除能力。

图7 茶多糖对DPPH自由基的清除效果Fig.7 The clearance effect of tea polysaccharides on DPPH radical

2.3.3 茶多糖对玉米油的抗氧化效果 玉米油富含不饱和脂肪酸，长期暴露在空气中易发生自氧化反应，导致油体酸败变质[33]。图8展示，茶多糖对油脂具有良好的抗氧化效果，添加过茶多糖的油体样品的POV值较空白样品均有一定程度的下降，并且下降幅度与茶多糖添加量表现出明显的量效关系。茶多糖添加量为0.05%时，其抗氧化效果强于0.02%VC；添加量相同时，其抗氧化效果低于VC。

图8 茶多糖对油脂的抗氧化效果Fig.8 The antioxidant activity of tea polysaccharides on grease

3 结论

本文采用超声波辅助方式提取凌云白毫茶多糖，并利用Box-Bohnken法优化试验方案，获得该工艺的回归方程。方差分析表明，回归方程极显著，与试验操作拟合程度高。对回归方程进行最优化处理获得茶多糖提取工艺的最佳条件：液料比69:1 mL/g、提取温度52 ℃、超声时间21 min、超声功率180 W。最佳条件下，实测茶多糖平均得率为4.84%，与回归方程预测值5.06%相当（<5%），说明所得工艺条件具有一定的实用价值，可用于茶多糖的提取。凌云白毫茶多糖对常见自由基如·OH、DPPH·均具有一定的清除效果，其中，对DPPH·的清除能力（IC50=0.438 mg/mL）强于著名绿茶品牌西湖龙井（IC50=0.489 mg/mL）和信阳毛尖（IC50=0.443 mg/mL）。此外，茶多糖可抑制油脂的自氧化反应，延长油脂在常温常压环境中的存储时间。抗氧化性试验结果表明凌云白毫茶多糖具有良好的抗氧化效果，并且抗氧化能力与茶多糖浓度成正向关系。凌云白毫茶多糖含量丰富，经常饮用对于维护人体正常的生命活动具有积极效果。茶多糖也可作为一种天然抗氧化剂，具有一定的开发价值。以上结果可为凌云白毫在国内外的深度推广及产品开发提供理论依据和数据参考。