马芬芬，王 彦，朱映红，徐海涛

0 引 言

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种血管病变疾病，心脑血管疾病的主要诱因，严重影响人类生命健康，平滑肌细胞是血管壁的重要成分，调节着血管的收缩舒张功能，同时也分泌多种细胞因子，进而促进炎症反应；以往认为动脉粥样硬化形成过程中，主要由血管平滑肌细胞增殖为主，但最近研究证明，在动脉粥样硬化斑块中存在血管平滑肌细胞凋亡现象；且血管平滑肌细胞由收缩表型向其他表型的转换可影响动脉粥样硬化的发生发展[1-4]。落新妇苷是广泛存在于多种植物中的二氢黄酮醇苷，黄酮类化合物的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等多种药理活性[5]。研究报道落新妇苷预处理可减轻大鼠肝缺血再灌注损伤[6]。落新妇苷通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)信号通路和抑制P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)信号通路减轻过氧化氢诱导的PC12细胞损伤[7]。落新妇苷可减轻高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的炎症[8]。落新妇苷对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)诱导的血管平滑肌细胞凋亡、炎症反应的影响及机制尚不清楚。miR-613是miRNA的一种，位于12号染色体上，研究报道miR-613通过靶向程序性细胞死亡分子10(Homo sapiens programmed cell death 10，PDCD10)抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡[9]。miR-613过表达可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和炎症反应[10]。miR-613对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡、炎症反应的影响及落新妇苷是否调控miR-613的表达尚不清楚。本实验旨在研究落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡、炎症反应的影响及机制是否与miR-613有关。

1 材料与方法

1.1 材料人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)(上海烜雅生物科技有限公司)；F-12K培养基(上海莼试生物技术有限公司)；氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)(上海信帆生物科技有限公司)；落新妇苷(青岛捷世康生物科技有限公司)；凋亡检测试剂盒(北京金克隆生物技术有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海北诺生物科技有限公司)；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved-caspase3)多克隆抗体、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-9，cleaved-caspase9)多克隆抗体、山羊抗兔IgG-HRP(美国Abbkine)；白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒(上海沪震实业有限公司)；Trizol试剂(北京诺博莱德科技有限公司)；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(上海善然生物科技有限公司)。miR-NC、miR-613模拟物、抑制剂及阴性对照等均购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 细胞处理与分组人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)于F-12K培养基中培养，采用数字表法随机选取部分HA-VSMC，用50 mg/mL的oxLDL处理HA-VSMC 24 h作为oxLDL组，用等渗盐水进行处理的作为对照组；分别用5 、10、20 μmol/L落新妇苷处理oxLDL组细胞，记为oxLDL+落新妇苷低、中、高剂量组；将miR-613模拟物(miR-613 mimics)及阴性对照(miR-NC)转染至HA-VSMC后用50 mg/mL的oxLDL处理，记为oxLDL+miR-NC组、oxLDL+miR-613组；将miR-613抑制剂(miR-613inhibitor)及阴性对照(anti-miR-NC)转染至HA-VSMC后用50 mg/mL的oxLDL和20 μmol/L落新妇苷处理，记为oxLDL+落新妇苷+anti-miR-NC组、oxLDL+落新妇苷+anti-miR-613组。miR-613 mimics：5′-AGGAATGTTCCTTCTTTGCC-3′，miR-NC序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTT；miR-613 inhibitor：5′-GGCAAAGAAGGAACATTCCT-3′， anti-miR-NC：5′-ATCCGTAGGCGTTAGCCTAT-3′。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡情况收集各组培养48 h的细胞，用预冷的PBS漂洗2次，用结合缓冲液混重悬，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，避光孵育10 min；置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡流式图4个象限中左下为正常细胞，左上为坏死细胞；右上为晚期凋亡细胞，右下为早期凋亡细胞。

1.2.3Western blot法检测蛋白表达收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，将蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，经5%脱脂奶粉封闭后，加入兔抗人cleaved-caspase3多克隆抗体、兔抗人cleaved-caspase9多克隆抗体在4 ℃条件下孵育过夜；然后加入山羊抗兔IgG-HRP室温下孵育2 h，曝光显影，成像后分析蛋白条带灰度值，以GAPDH计算蛋白相对表达水平。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、TNF-α水平取培养48 h后各组细胞的上清液，按照试剂盒说明操作，酶标仪测定A450值；以标准物的浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的A值由标准曲线查出相应的浓度。

1.2.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-613表达水平提取细胞总RNA，合成cDNA，以U6为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算，其中△△Ct公式如下：

△△Ct=(实验组Ct-内参U6 Ct)-(对照组Ct-内参U6 Ct)

miR-613上游引物序列：5′-CTTCGTCGGCTCTTCCATACATACT-3′，下游引物序列：5′-TTCACTTAGATACAGCTACGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 结 果

2.1 落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响与对照组比较，oxLDL组血管平滑肌细胞的凋亡率升高，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达水平升高(P<0.05)；与oxLDL组比较，oxLDL+落新妇苷低、中、高剂量组血管平滑肌细胞的凋亡率降低，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达水平降低(P<0.05)，呈剂量依赖性。见图1、图2。

1：对照组；2：oxLDL组；3：oxLDL+落新妇苷低剂量组；4：oxLDL+落新妇苷中剂量组；5：oxLDL+落新妇苷高剂量组

2.2落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响与对照组比较，oxLDL组血管平滑肌细胞中IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；与oxLDL组比较，oxLDL+落新妇苷低、中、高剂量组血管平滑肌细胞中IL-1β、TNF-α水平降低，呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

1：对照组；2：oxLDL组；3：oxLDL+落新妇苷低剂量组；4：oxLDL+落新妇苷中剂量组；5：oxLDL+落新妇苷高剂量组

表 1 落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响

2.3落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞miR-613表达的影响与对照组比较，oxLDL组血管平滑肌细胞中miR-613表达水平降低(P<0.05)；与oxLDL组比较，oxLDL+落新妇苷低、中、高剂量组血管平滑肌细胞中miR-613表达水平升高，呈剂量依赖性(P<0.05)。见图3。

2.4miR-613过表达对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响与oxLDL+miR-NC组比较，oxLDL+miR-613组miR-613表达水平升高(1.00±0.00vs3.45±0.00，P<0.05)，血管平滑肌细胞的凋亡率降低，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图4、图5。

1：对照组；2：oxLDL组；3：oxLDL+落新妇苷低剂量组；4：oxLDL+落新妇苷中剂量组；5：oxLDL+落新妇苷高剂量组

2.5miR-613过表达对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响与oxLDL+miR-NC组IL-1β水平[(43.33±4.23)pg/mL]、TNF-α水平[(89.15±5.61)pg/mL]比较，oxLDL+miR-613组[(17.98±1.26)、(46.31±4.59)pg/mL]降低(P<0.05)。

1:oxLDL+miR-NC组; 2:oxLDL+miR-613组

与oxLDL+miR-NC组比较，*P<0.05

2.6干扰miR-613表达逆转了落新妇苷(20 μmol/L)对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡和炎症反应的作用与oxLDL+落新妇苷+anti-miR-NC组比较，oxLDL+落新妇苷+anti-miR-613组miR-613表达水平降低，血管平滑肌细胞的凋亡率升高，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达水平升高，IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。见图6、图7，表2。

1：oxLDL+落新妇苷+anti-miR-NC组; 2:oxLDL+落新妇苷+anti-miR-613组

a:流式细胞仪检测; b:凋亡率比率

表2 干扰miR-613表达逆转了落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的作用

3 讨 论

动脉粥样硬化是导致心脑血管疾病发病和死亡的首要原因，炎症反应是动脉粥样硬化发病的重要机制之一，贯穿动脉粥样硬化病变的整个过程[11-12]。因此，干预炎症反应是抑制动脉粥样硬化的有效途径和重要策略，而中医药具有干预炎症反应的作用[13]。研究报道落新妇苷可抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡[14]。落新妇苷可以通过减少氧化应激和炎症减轻顺铂诱导的肾毒性[15]。落新妇苷可通过抑制MAPK途径和激活AKT途径来抑制细胞凋亡和炎症，从而抵抗脑缺血再灌注损伤[16]。以上研究表明落新妇苷可通过抗炎和抗氧化的作用保护细胞免受损伤。本实验用oxLDL诱导的血管平滑肌细胞建立损伤模型，然后不同剂量落新妇苷处理，结果显示，细胞的凋亡率降低，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达水平降低，IL-1β、TNF-α水平降低，且呈剂量依赖性；表明落新妇苷可剂量依赖的抑制oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡及炎症反应。

研究报道lncRNA RMRP通过miR-613/ ATG3轴和JAK2 / STAT3途径保护脑缺血再灌注损伤[17]。且已有研究表明miR-613可影响心肌细胞凋亡以及软骨细胞凋亡和炎症反应[9-10]。说明miR-613可参与调控细胞损伤。本实验结果显示，oxLDL诱导的血管平滑肌细胞中miR-613表达水平降低；提示miR-613可能参与，oxLDL诱导的血管平滑肌细胞损伤。本实验还发现过表达miR-613可降低细胞凋亡率及IL-1β、TNF-α水平；表明过表达miR-613可抑制oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡及氧化应激。此外，本实验还发现落新妇苷处理可提高miR-613表达水平；而干扰miR-613表达逆转了落新妇苷对oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡和炎症反应的作用。

综上所述，落新妇苷通过上调miR-613的表达抑制oxLDL诱导的血管平滑肌细胞凋亡、炎症反应。