文/周圣翔 张彩红 冯广智

双酚A (Bisphenol A, BPA)，学名2，2-二（4-羟基苯基）丙烷，简称二酚基丙烷。因具有和天然雌激素相似的结构而具有类雌激素活性，被称为酚类环境雌激素，通常经由食物、汗渍或水洗等与皮肤的接触进入生物体内形成假性激素，传送假性化学信号并影响生物体内激素含量，进而干扰内分泌的原本机制，造成内分泌失调，危害生物体生殖机能甚至诱发恶性肿瘤。双酚A因其良好的应用特性被当作增色剂、洗涤剂、乳化剂和阻燃剂等广泛使用，同时也是芳香族合成鞣剂中一种重要的原料。

目前，国内外对双酚A的检测分析方法主要有高效液相法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法，高效液相色谱-质谱联用法等。高效液相法适合于高沸点化合物的检测，具有分离效率高、选择性高、灵敏度高、分析速度快等特点，现阶段对双酚A的检测也多是用高效液相色谱法，但该法仅通过与标准色谱图中的保留时间比对作为定性的条件，当样品基质复杂，前处理无法对样品液净化干净时，会对准确定性定量带来极大的干扰。气相色谱法对双酚A的测定灵敏度虽然高于高效液相法，但是酚类物质沸点高，挥发性差，常需要衍生化，同时也无法避免假阳性的干扰。相比于气相色谱法，气相色谱-质谱联用法能充分结合气相色谱对复杂有机化合物进行有效分离和质谱对化合物进行准确定性的优点，是最成熟的质谱联用技术，常用于酚类物质的有效分析。液相色谱-质谱联用法能通过杂交质谱对样品进行检测分析，不仅能准确定性和定量，并能排除基质的干扰，但目前仪器设备过于昂贵，不易于推广。

目前，国内外对双酚A的检测应用主要在食品接触材料及其制品、玩具、纺织品以及水体、土壤、空气等环境样品，而国内对皮革及其制品中双酚A的检测还是个空白，我国是世界上最大的皮革制品制造国家，皮革制品的出口和消费多年位居轻工行业的首位，因此，建立一种测定皮革中双酚A的检测方法尤为迫切和重要。本文中采用的是气相色谱-质谱联用法并进行优化，该检测方法简单快捷，结果稳定可靠，适用于皮革中双酚A含量的测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：TRACE-1300/ISQ 7000气相色谱-质谱联用仪（赛默飞公司）；恒温超声仪（SBL-72DT）；分液漏斗振荡器（EYELA MMV-1000W）；台式高速冷冻离心机（Sigma 3K15）。

试剂：双酚A标准品（纯度99.9%）；水（三级水）；甲醇、正己烷、乙腈、丙酮、四氢呋喃（均为色谱纯，安谱公司）；三乙胺、乙酸酐、碳酸钾（均为分析纯，国药集团）。

1.2 分析步骤

将样品剪碎至2mm～3mm的小块，称取1g（精确至1mg）的试样至可以旋紧密闭的50mL提取瓶中，加入10mL的甲醇，在40℃下恒温超声60min。取出快速冷却后，将提取液过滤至分液漏斗中，加入40mL的0.1mol/LKCO溶液，另外用5mL的KCO溶液洗涤残渣，重复两次，合并提取液。然后加入2mL的乙酸酐和1mL的三乙胺，将分液漏斗置于振荡器上振荡5min（振荡频率≥250次/min），待充分衍生后取下分液漏斗，加入5mL的正己烷，然后在振荡器上继续振荡10min。静置待两相分离后，过滤上层有机相，使用气相色谱-质谱联用仪分析。

1.3 仪器条件

色谱柱：TG-5SILMS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：280℃；进样模式：不分流；载气：高纯度氦气；进样量：1μL；升温程序；80℃，保持1min，以30℃/min的速度升温至280℃，保持2min。

2 结果分析

2.1 乙酰化的选择

双酚A带有两个极性很强的羟基，且熔沸点很高，挥发性差，如果直接进样分析，使用常用的毛细管色谱柱会导致目标峰拖尾严重，分离效果较差，灵敏度较低，给定性定量造成困难。而双酚A和乙酸酐发生乙酰化反应可以生成稳定的酯类物质，降低极性，降低熔沸点，提高分离度，故本方法采取对样品进行衍生化处理。双酚A和乙酸酐的乙酰化反应方程式如图1。

图1 双酚A和乙酸酐的乙酰化反应方程式

2.2 样品前处理条件的选择

目前，对于皮革样品中的有害物质，常用的提取方式有索氏提取法、水蒸气蒸馏法、超声波提取法、微波加热溶剂提取法等。索氏提取法回收率高，重现性好，但消耗溶剂大，提取时间过长。水蒸气提取法虽然得到的提取液比较干净，但需要搭建蒸馏装置，操作比较繁琐，不适于大批量分析测试样品。微波加热溶剂提取方法操作简单，提取时间短，使用溶剂少，但设备昂贵。综合考虑，本文采用了超声波提取法，该方法具有操作简单、重现性好、仪器设备便宜、效率较高等优点。

本文考察了不同的提取溶剂（水、甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃），不同的提取温度（25℃、40℃、50℃、60℃）和不同的提取时间（10min、30min、60min、90min）对提取效果的影响，在不含双酚A的空白皮革试样中加入一定量的标样，按照不同的提取条件进行正交试验，试验结果见图2、图3和图4。

图2 不同溶剂对提取效果的影响

从图2结果可知，甲醇、乙腈和丙酮的提取效果较好，四氢呋喃和水的提取效果较差，再考虑到试剂的易取性和毒性，选择甲醇作为提取试剂。

图3 不同温度对提取效果的影响

图4 不同提取时间对提取效果的影响

比较图3的结果，发现较低的温度和较高的温度，都会导致提取效果变差，而试样在40℃下有最好的提取效果。

根据图4结果可知，提取效果随着提取时间的增加而提高，且在60min后趋于平稳，表明试样在提取60min后，已经能得到充分的提取。同时，还考虑到在乙酰化后的液液振荡萃取过程中，振荡频率可能会对萃取效果有影响，通过不同的振荡频率（150次/min、200次/min、250次/min、300次/min）进行试验，试验结果见图5。

图5 不同振荡频率对液液振荡萃取效果的影响

从图5结果可知，随着振荡频率的提高，萃取效果有明显提高，在振荡频率提高到250次/min后，萃取效果放缓，因此选择250次/min作为最佳的振荡频率。

根据以上结果分析，最终确定方法的最优前处理条件为：甲醇作为提取溶剂，在40℃下超声提取60min，乙酰化后的液液振荡萃取过程采用250次/min的振荡频率。

2.3 样品液的净化和仪器方法的选择

试验过程中发现，样品液在液液萃取后都能得到澄清的有机相，可以使用0.22μm的有机滤膜过滤后直接上机测试，如果遇到萃取液混浊的情况，可以先使用高速离心机进行离心，再过滤上机。但考虑到皮革中成分复杂，会有基质干扰，为了得到准确的结果，本文的仪器方法采取不分流模式进样，先使用全扫描模式定性分析，再使用选择离子（SIM）模式定量分析。使用本文设置的仪器条件和分析方法，衍生物双酚A二乙酸酯在低浓度下依然有较高的响应信号，目标化合物在8.9min出峰，峰型尖锐对称，分离效果良好，在目标峰保留时间范围内没有其他杂质峰的干扰，可以准确定性定量。（双酚A二乙酸酯色谱提取图见图6，质谱图见图7），

图6 双酚A二乙酸酯色谱提取图

图7 双酚A二乙酸酯质谱图

2.4 方法的线性范围与检出限

按照0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg、25.0mg/kg的浓度配制标准曲线，得到线性回归方程：

y

=-47758.06+1067286.63

x

，相关系数为0.9994，此方法的线性关系良好。以双酚A二乙酸酯响应的3倍信噪比和10倍信噪比分别计算双酚A的检出限和定量限，测得检出限为0.1mg/kg，定量限为0.4mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

分别将3个不同浓度的标准溶液添加至不含双酚A的空白皮革样品中，按照上面的最优试验条件进行加标回收试验，每个浓度进行6次水平试验，测得回收率和精密度，结果如表1所示。该方法的双酚A回收率在94.46%～102.94%，相对标准偏差在2.44%～4.29%，数据表明该方法具有良好的准确度。

表1 方法回收率和精密度（n=6）

2.6 随机样品抽取测试

抽取牛皮、羊皮、猪皮、鳄鱼皮等总共30个不同的样品，按照上述方法进行测试，结果见表2。

表2 随机样品抽取测试结果

测试结果表明，国内的皮革制品在生产过程中确实有使用双酚A，头层牛漆皮的检出频率较高，如样品2是一块杏色头层牛漆皮，含量为2.30mg/kg；样品21是一块黑色头层牛漆皮，含量为5.72mg/kg。因此日后可以着重对头层牛漆皮的样品进行检测。

3 结论

本文建立了一种通过超声提取皮革样品，提取液经过乙酰化反应后使用气相色谱-质谱联用仪测定皮革中双酚A的检测方法。该方法检出限低，回收率高，操作简单，适合批量检测，相比于常用的高效液相法，结果更加准确可靠，适用于皮革中双酚A含量的测定。