化 柯,蒋 豫,吴元强,杨 楠,刘 新

藻源可溶有机质对17β-雌二醇生物降解的影响

化 柯1,蒋 豫2,吴元强1,杨 楠1,刘 新1*

(1.南京林业大学生物与环境学院,江苏 南京 210037；2.江苏省生态环境评估中心(江苏省排污权登记与交易管理中心),江苏 南京 210036)

为探究藻源可溶有机质(COM)及其生物老化过程对湖泊水体中17β-雌二醇(E2)生物降解的影响特征,通过模拟生物老化,得到5种不同生物活性的COM样品:S0(78%)>S1(67%)>S2(36%)>S3(13%)>S4(1%).结果表明,经过60h的避光培养实验,相同浓度(8mgC/L)的COM样品均提高了微生物群落对E2的一级动力学降解速率,大小顺序为:S0>S4>S3>S1>S2.微生物分析表明,新鲜COM中高活性组分既促进了微生物群落的生长,也维持了较高的群落多样性.而培养期间中、低活性COM组分难以作为微生物的有效碳源,导致微生物量和E2降解速率显著降低.其中,S3和S4处理组中大量累积的芳香族和腐殖质结构可能利于潜在E2降解菌的存活并激发污染物降解酶的表达,进而提高生物量标准化E2降解速率.富营养化水体中雌激素的环境行为和归趋与COM的生物活性密切相关.

蓝藻水华；可溶有机质；雌激素；三维荧光-平行因子分析；微生物群落

类固醇雌激素(SEs)是一类具有亲脂性、低分子量、强内分泌干扰作用的内分泌干扰物[1],极低浓度水平(ng/L或更低)就可对生物和生态环境造成严重危害[2-3].目前,全球范围内多个湖泊、河流等水体中均已检测出相当浓度的SEs[4-7],富营养化水体蓝藻暴发与SEs共存的情况十分普遍,且SEs浓度呈现明显的季节变化特征[8].天然水体中SEs的自然衰减和生态毒性与微生物群落密切相关,特别是当水体透明度较低时,光分解往往受到限制,微生物降解成为SEs主要的降解途径.微生物对污染物的分解过程通常受多种环境因素影响,例如溶解氧、温度、生长基质等.其中,可溶有机质(DOM)是自然界中微生物最重要的生长基质和能量来源,在污染物生物降解过程中具有重要作用[9].

湖泊等地表水体中DOM的主要来源包括陆源和生源[10].近年来,气候变化和富营养化加剧导致蓝藻水华频繁暴发,蓝藻生长和消亡过程产生大量的的陆源物质向高新鲜度、低分子量的生源物质(如碳水化合物和氨基酸)转变[11],同时也影响微生物群落结构及代谢途径表达[12].与陆源DOM相比,COM更容易被微生物分解,伴随着易降解物质的快速消耗和难降解物质的累积,生物老化过程中COM结构和生物活性(即能够被微生物利用的程度)呈现动态变化[13].天然湖泊中DOM的结构组成变化通常较为明显[14],这种变化可能会影响DOM与SEs的络合、吸附、共代谢等作用进而影响SEs的归趋[15].相较于已被广泛研究的DOM浓度对污染物生物降解的影响,生物活性是更关键的影响因素[15].目前大部分研究主要关注标准品、污水和陆源DOM对SEs生物降解的影响[16-18],关于COM及其生物老化过程在SEs生物降解中的介导作用仍不清楚.

太湖是我国第三大淡水湖泊,以铜绿微囊藻为主的有害蓝藻和相当浓度的SEs造成了严重的复合污染和生态风险[19-20].因此,本文以雌二醇(E2)作为SEs代表,从太湖蓝藻中提取新鲜COM,采用四级推流式生物膜反应器模拟生物老化过程,得到不同活性的COM样品,通过培养实验研究不同生物活性COM对水体中E2生物降解潜力的影响,结合微生物分析研究了微生物群落结构和组成的变化.

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

2018年7月在太湖梅梁湾采集含蓝藻藻浆的表层水样(0～5cm),经0.7μm玻璃纤维滤膜(450℃预烧4h,下同)过滤后,取滤膜上的蓝藻样品(干重约10g)添加到100mL模拟湖水中[21],室温、避光条件下振荡以模拟COM的释放过程.经过5d后,将混合液经0.22μm滤膜过滤后得到新鲜的COM样品.

在太湖梅梁湾采集表层沉积物(5cm)并制备E2降解菌群[16]:将100g沉积物与800mL湖水混合,振荡24h后静置.将上覆水过滤(1.2μm)后,高速离心滤液(10000×)30min.弃掉上清液后,将残留的微生物菌群转移到含有100μg/L E2的湖水中培养3d.确认菌群具有E2降解能力后,离心混合液,用10mmol/L磷酸缓冲盐溶液反复洗涤微生物菌群,作为接种菌.

E2水溶液配置:将标准样品溶于甲醇得到E2标准溶液,取一定量E2标准溶液置于灭菌玻璃瓶,待甲醇挥发后加入超纯水并超声30min得到E2水溶液.

1.2 COM生物老化过程模拟

采用四级推流式生物膜反应器(图1)模拟COM的生物老化过程,具体参数与先前文献描述一致[22].将新鲜的COM样品通过蠕动泵(0.5mL/min)泵入反应器,各级的水力停留时间依次为4,20,24,48h.进水中的高活性组分最先消耗,其次是中活性组分,而难降解组分难以被分解,故COM的生物活性沿各级单元逐步降低.收集反应器进水和各级出水,重复3次,标记为S0、S1、S2、S3和S4并冷冻储存.

采用Sigma Plot软件(12.0版本)进行G方程拟合[23],G模型定义COM中的可生物降解组分的降解过程符合一级降解动力学,其计算见式(1):

式中:C1、C2和C3分别为COM高、中、低活性组分的DOC浓度,mgC/L;t为时间,d;k1、k2为降解系数,d-1.高、中活性组分之和视为COM的生物活性.

1.3 COM对E2生物降解的影响

室温(25±2)℃下开展避光微宇宙体系实验.具体为:将相同浓度的不同COM样品添加到具棉塞锥形瓶中,添加一定体积E2水溶液、接种菌液及超纯水.体系参数为:总体积200mL,微生物浓度(干重)为0.5mg/L,DOC为8mg/L,E2为100μg/L.DOC浓度根据蓝藻水华发生下水体DOC浓度范围选取[19],还添加了适量氮储备液(NH4+-N为2.05mg/L,NO3–-N为4.85mg/L).同时设置未加入DOM的对照组、以及未接种菌群的非生物对照组.室温下避光培养,每天手摇3次.在0,4,8,16,24,32,40,48,60h各取10mL样品经0.22μm玻璃纤维滤膜过滤后测定E2浓度.在实验初期和末期取完全混匀样品进行过滤(0.22μm无菌聚碳酸酯滤膜),提取滤膜上的细菌菌群,进行高通量测序和定量PCR.所有实验均设置3个平行.

采用一级动力学方程拟合E2生物降解过程:

式中:0为初始E2浓度,μg/L;C为在(h)时的E2浓度,μg/L;为降解系数,h–1.

1.4 理化性质表征与微生物分析

采用总有机碳分析仪(TOC–Vcph,岛津)测定DOC浓度.紫外-可见分光光度计(UV-2550,岛津)收集吸收光谱,扫描范围为200～800nm,间隔1nm,计算紫外吸收比(SUVA254)、光谱斜率比R(275～295/350～400)等指标[24].荧光分光光度计(F-7000,日立)收集三维荧光光谱(EEMs),扫描灯源为700V氙灯,激发波长(x)和发射波长(m)分别为250～550nm和200～450nm,扫描间距分别为1和5nm,扫描速度2400nm/min,狭缝带宽为5nm,使用超纯水对EEMs进行拉曼散射峰、滤光内效应和瑞利散射效应校正[25].计算腐殖化指数(HIX)[24-26].通过MATLAB (R2012a)中的drEEMs工具箱(ver.0.2.0)进行三维荧光-平行因子分析(EEM-PARAFAC)[25].

E2固相萃取:水样以3mL/min的流速通过经甲醇和超纯水活化后的固相萃取柱(Waters Oasis HLB,6mL,500mg),萃取后抽滤30min,用9mL甲醇洗脱后置于40℃氮吹,最终由甲醇定容.采用高效液相色谱(Agilent 1200系列)定量,具体为: Waters C18反相柱(4.6mm×150mm,5μm,Agilent),柱温25℃,结合荧光检测器(x/m=280/310)定量,运行时间15min,进样量为20μL,流动相为超纯水和乙腈(50/50,/),流速为1mL/min.采用外标法对E2定量.预试验表明,固相萃取可以排除DOM对SEs定量的干扰.

采用PowerSoil试剂盒(Mo Bio Laboratories, Carlsbad,CA)提取样品DNA,一式2份.采用正向引物515F(5ʹ-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3ʹ)和反向引物907R(5ʹ-CCGTCAATTCCTTTGAGT- TT-3ʹ)对16S rRNA V4-V5片段进行PCR扩增,反应体系为:0.2μmol/L引物、0.2mmol/L dNTP、1.5mmol/L MgCl2、0.2单元的Taq聚合酶.扩增条件为:预变性95℃,2min;95℃变性30s;55℃退火30s;72℃延伸30s,共30次循环,最终在72℃扩增5min.凝胶纯化后由美吉生物科技有限公司进行Illumina MiSeq测序(Illumina,San Diego,USA).通过QIIME v1.6.0对序列进行质量控制.按cutoff为0.03将获得的序列按97%的相似性进行OTU划分.对微生物群落进行了门和纲水平的统计.采用MOTHUR软件分析微生物群落的α多样性(Shannon指数),采用R语言软件进行nMDS分析(β多样性).

1.5 统计学分析

采用Origin 8.5计算平均值和标准差,采用单样本T检验进行结果比较,<0.05认为有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 COM的组成及生物活性

模拟生物老化过程中新鲜COM的DOC浓度变化如图2所示.在最初24h内,DOC浓度由(13.21± 1.47)mg/L迅速降低至(4.70±0.45)mg/L,随老化时间延长,最终趋于稳定达到(3.03±0.04)mg/L.通过G模型拟合(2=0.99,<0.001),新鲜COM(S0)中高活性、中活性和低活性成分比例分别为31%、47%、22%.比较S1、S2、S3、S4的DOC浓度,发现S1、S2、S3、S4主要由中、低活性物质组成,特别是S3和S4几乎完全由难降解物质组成(表1).5种DOM样品的具体生物活性大小为:S0(78%)>S1(67%)>S2(36%)>S3(13%)>S4(1%).

图2 四级推流式生物膜反应器DOC变化的G模型拟合

吸收光谱表明,随着生物活性降低,COM的SUVA254值逐渐升高,从S0的(0.76±0.04)L/(mgC×m)最后上升至S4的(1.35±0.11)L/(mg C×m),而与分子量大小成反比的R值则呈现降低趋势[27],由S0的(1.63±0.12)降低至S4的(0.90±0.07).荧光光谱图表明,新鲜COM的HIX值随着生物老化过程由(0.90±0.05)升高至(1.57±0.07).进一步通过EEM- PARAFAC分析结合半检验验证得到4个独立荧光组分(图3).组分1(C1)的激发和发射光谱的最大值分别在275和315nm处,归类为类酪氨酸组分[28].组分2(C2)的激发光谱在235和280nm处出现2个激发峰,发射最大值出现在340nm处,为类色氨酸组分.组分3(C3)在240和310nm处出现激发最大值,发射最大值在405nm处,为类富里酸组分.组分4(C4)在275和460nm处出现激发峰,在360和460nm处出现发射峰,为类腐殖酸组分.新鲜COM中C1和C2等类蛋白组分含量高达76%,C3和C4等类腐殖组分占24%.与HIX变化一致,类蛋白组分在生物老化中优先被消耗,而类腐殖组分相对分布则逐渐增加.

表1 模拟生物老化过程中COM的特征变化

注:DOC均为8mgC/L;C1,C2,C3和C4分别代表类酪氨酸组分、类色氨酸组分、类富里酸组分以及类腐殖酸组分.

2.2 不同生物活性COM对E2生物降解的影响

如图4(a)所示,E2生物降解动力学符合一级动力学模型(2>0.90,<0.001).与对照组相比,添加不同生物活性的COM均显著加快了E2生物降解,而不同生物活性的COM的促进作用也存在差异.其中新鲜COM(S0)的促进作用最强,将E2生物降解速率从(0.02±0.00)h–1提高到(0.10± 0.01)h–1(图4b).随着DOM生物活性降低,S1、S2组中E2降解速率剧烈降低.然而,生物活性极低的S3和S4组中E2降解速率(0.06±0.00)h–1却显著高于S1、S2组(<0.001). qPCR定量分析表明,所有添加DOM处理组中微生物群落的16S rRNA基因拷贝数均高于对照组,其中S0组最高,随着DOM生物活性降低而逐渐降低(图4c).基于qPCR定量结果,将各组中的E2降解速率进行生物量标准化分析.如图4(c)所示,S3和S4组中生物量标准化降解速率最高,其次为S0组,而S1和S2组中降解速率最低.表明生物老化改变了COM对E2生物降解的影响.

2.3 微生物群落演化

Illumina高通量测序分析共产生125844个序列,按cutoff为0.03将获得的序列按97%的相似性划分共得到1376个OTU.由图5(a)可见,S0组的物种多样性最为丰富,而S1～S4组的多样性依次降低. nMDS分析表明(图5b),S0、S1、S2和S3组的群落相似性更强,而S4组则没有与其他组聚类,表明COM的生物活性对微生物群落演化具有调控作用.

在纲和属水平进一步表征了微生物群落组成,不同处理组中微生物群落组成相似.纲水平的微生物群落组成如图6(a)所示,处理组中的主要菌种包括芽孢杆菌纲(Bacilli)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)以及鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia).其中S0组中优势菌种为β-变形菌纲和鞘脂杆菌纲,而生物活性较低的S1～S4组中芽孢杆菌纲的相对丰度高于S0组.

在属水平上构建了聚类关系树热图(图6b).可以看出,S0组的物种丰富度更高,不同组别群落组成则呈现出明显的差异性.S0组主要以、黄杆菌属()、地杆菌属()、、、乳球菌属()、劳尔氏菌属()、噬氢菌属()、、芽孢杆菌属()、丰佑菌属()等菌属为主,而S1和S2组中的噬氢菌属、、芽孢杆菌属、丰佑菌属显著高于其他处理组S2组的、S3组的以及S4组中的单胞菌属()、短波单胞菌属()为各组独特的优势菌属(丰度显著高于其他组).

2.4 讨论

随着COM的生物老化过程,SUVA254和HIX指数逐渐升高,这是由于芳香族化合物的生物活性较低,而微生物分解也会将糖类、蛋白质等高活性物质转化为腐殖质[29-30].EEM- PARAFAC分析证实COM生物老化过程中类蛋白组分相对含量逐渐降低,而类腐殖酸和类富里酸组分发生富集.相较于高分子组分,小分子组分更易被微生物分解.COM的生物老化过程会导致其分子量升高.先前研究证实DOM中含氧小分子会被微生物优先代谢,同时产生高分子量物质作为副产物[22].可以看出,生物老化过程改变了COM的结构组成和生物活性,这种动态变化可能进而影响了其对E2生物降解的介导作用.

在培养初期(0～4h),微生物群落尚未适应碳源变化,生物吸附占主导地位[31].随着培养时间推移,不同生物活性的COM均促进了E2的生物降解,表明COM的生物活性会对污染物生物降解产生显著影响[15].不同处理组降解速率不同,S0组中微生物量显著高于其他组,说明新鲜COM中的高活性组分是促进微生物生长的关键组分,其富含的蛋白质类、糖类等易降解组分能在短期内参与微生物的代谢并维持不同细菌生长.而中、低活性组分由于自身分解周期较长,在培养期间难以作为微生物的生长基质.虽然有研究报道高活性物质(如葡萄糖和植物提取液)可能会通过底物竞争或碳分解代谢阻遏作用抑制微生物对污染物的降解[32-33],但这些物质在COM中含量有限.S0组中微生物量和E2降解同步升高表明微生物在利用COM中高活性组分的同时可能通过共代谢提高了对E2的分解.较高的生物量标准化降解速率也证实了微生物对E2的代谢活性增强.

在S1～S4组中,E2降解速率与生物量大小并不一致:虽然S3和S4组中微生物量较低,但E2降解速率反而高于S1和S2组,表明微生物量并不是控制E2降解的唯一因素.S3和S4组中大量的低活性成分营造了一个极度碳匮乏的贫营养环境,微生物首先适应碳源变化,并在适应期内(24h)诱导了某些善于利用难降解物质的菌的代谢活性,这可能激发微生物选择E2作为可利用的代谢物质.贫营养条件下污染物降解菌的生长通常依赖于非特异性代谢酶的连续、广泛表达[34],微生物体内污染物降解酶的表达会随DOM中芳香族化合物含量升高而增强,进而提高其分解能力[35],S3和S4组中积累的芳香族化合物可能起到了相同的作用.在极度寡营养环境中,对难降解污染物如E2具有较强代谢潜力的微生物种群更易存活,S3和S4组中生物量标准化E2降解速率最高也证实了这一推论.

微生物群落分析表明,COM和E2共存导致微生物群落发生了部分重建.S0组中COM成分最为复杂,可维持不同代谢能力的包括E2潜在降解菌在内的微生物群落生长,因此微生物多样性最高.随着生物活性组分含量降低,微生物之间互相竞争有限碳源,促使微生物群落多样性逐渐降低.微生物群落组成和结构的演化与其对E2的生物降解潜力密切相关.例如,S0组中丰富的COM组分维持了最为丰富的细菌组成,多种潜在降解菌的共存造就了其最高的E2降解潜力.有研究曾指出β-变形菌纲在雌激素降解中发挥重要作用[36],而S0组中β-变形菌纲的相对丰度显著高于其他组,说明在活性组分充足的情况下,β-变形菌纲能较好的生长,并作为主要降解菌促进了E2的降解.相反,活性成分较少的处理组中芽孢杆菌纲的相对丰度较高,表明其对贫营养环境的适应能力更强.属水平的热图分析进一步揭示了微生物群落组成与E2生物降解的潜在联系.S3和S4组中,贫营环境下具有E2降解潜力的特定属(、寡养单胞菌属和短波单胞菌属)得到富集[36],提高了群落对E2的生物降解能力.如S4组中寡养单胞菌属和短波单胞菌属的相对丰度比其他组高出1个数量级,说明它们在极度碳匮乏条件下可能作为E2的主要降解菌选择消耗其他物质如E2维持存活,实际上已经有研究分离出了一株属于寡养单胞菌属的E2降解菌,该菌能将E2转换成氨基酸酪氨酸[37],这在一定程度上解释了极低活性COM处理组中相对较高的E2降解潜力.此外,S4组中丰富的低活性物质迫使体系内细菌形成了独特的群落结构.同时,为保证群落的完整性,多底物分解过程中微生物群落成员之间通常呈现协同作用,故非E2降解菌的生长也可能会影响E2的生物降解.因此,微生物群落的变化是细胞生长和代谢变化的结果,而并非影响E2降解的直接原因.这也解释了E2降解菌丰度与E2降解速率的不一致性.

需要指出,研究可能高估了天然水体中低活性COM的影响.但总体而言,蓝藻水华过程中新鲜COM的释放显著促进了水体中E2的生物降解,而COM的生物老化过程弱化了这一促进作用.

3 结论

3.1 新鲜COM中高、中、低活性组分分别占31%、47%、22%,富含类蛋白组分,而生物老化过程显著降低了COM的生物活性(从78%至1%),并提高了COM的分子质量、腐殖度及类腐殖组分含量.

3.2 不同生物活性的COM均显著提高了E2的生物降解速率,其中新鲜COM提高了微生物群落的生物量以及多样性,而极低活性的COM虽然难以维持微生物群落生长却能通过调节微生物群落组成和结构促进E2的生物降解.

3.3 新鲜COM促进了潜在E2降解菌——β-变形菌纲的生长从而影响E2降解,而生物活性极低的COM会通过富集寡养单胞菌属和短波单胞菌属等潜在E2降解菌属提高E2降解潜力.

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Roles of cyanobacterial-derived dissolved organic matter in mediating biodegradation of 17β-estradiol in water column.

HUA Ke1, JIANG Yu2, WU Yuan-qiang1, YANG Nan1, LIU Xin1*

(1.College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China；2.Jiangsu Provincial Ecological Assessment Center (Jiangsu Provincial Management Center for Emissions Registration and Exchange), Nanjing 210036, China)., 2022,42(4)：1829～1836

The effects of cyanobacterial-derived dissolved organic matter (COM) and its microbial processing on the biodegradation of 17β-estradiol (E2) in lake water column were investigated in this study. Through the simulated microbial ageing within a four-stage plug-flow bioreactor, five COM fractions with a gradient of decreasing bioreactivity were separated: S0 (78%) > S1 (67%) > S0 (36%) > S0 (13%) > S0 (1%). Within the 60 hours of batch incubation at dark, the addition of COM fractions at 8mgC/L exhibited strong acceleration on E2biodegradation, increasing the first-order kinetic rate with the order of S0 > S4 > S3 > S1 > S2. Microbial analysis further showed that the highly labile compounds in COM not only promoted the bacterial growth but also maintained the diverse microbial community in the S0-amended group. In comparsion, the bacterial concentration and E2biodegradation rate in the S1- and S2-amended groups was remarkably lower, meaning that the semilabile and recalcitrant compounds were unable to serve as effective carbon sources. However, the enriched aromatic, humic structure in the S3- and S4-amended groups significantly increased the biomass-normalized E2biodegradation rate, possibly due to the selection of potentially E2-degrading bacteria and the activation of catabolic enzymes under carbon-limited conditions. The environmental behavior and fate of estrogens in eutrophic waters are closely related to the bioreactivity of COM.

cyanobacteria bloom；dissolved organic matter；steroid estrogens；EEM-PAPAFAC；microbial community

X172

A

1000-6923(2022)04-1829-08

化 柯(1997-),男,安徽阜阳人,南京林业大学硕士研究生,主要从事水污染控制与修复.

2021-09-18

国家自然科学基金资助项目(41907029)

*责任作者, 教授, xin126mail@126.com