陈静文 裴菱花 窦丽萍 王审 杨明 黄抒伟

[摘要] 目的 探讨血府逐瘀汤对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块负荷及炎症因子CXCL16、MMP-1表达的影响。方法 APOE基因敲除小鼠高脂饲料喂养8周后，油红O染色证实造模成功。将30只小鼠随机分为血府逐瘀汤高剂量组、低剂量组、对照组。4周后对每组主动脉根部切片的斑块面积进行测定，检测主动脉组织中CXCL16、MMP-1蛋白及mRNA的表达水平。结果 三组小鼠主动脉根部AS斑块平均面积为（0.047±0.019）、（0.073±0.018）、（0.079±0.011）mm2，高剂量组斑块面积小于低剂量组（P<0.05），低剂量组斑块面积小于对照组（P>0.05）。三组CXCL16蛋白的相对水平分别为（0.422±0.065）、（0.640±0.070）、（0.849±0.054），差異均有统计学意义（P<0.001）。MMP-1蛋白的相对水平分别为（0.260±0.031）、（0.535±0.050）、（0.736±0.039），差异均有统计学意义（P<0.001）。CXCL16 mRNA相对表达水平分别为（0.407±0.023）、（0.725±0.044）、（0.823±0.038），差异均有统计学意义（P<0.001）。MMP-1 mRNA相对表达水平分别为（0.392±0.034）、（0.513±0.033）、（0.668±0.046），差异均有统计学意义（P<0.001）。结论 血府逐瘀汤抑制AS小鼠主动脉斑块CXCL16、MMP-1的表达，高剂量干预下可降低斑块负荷。

[关键词] 动脉粥样硬化;血府逐瘀汤;CXCL16;MMP-1;小鼠

[中图分类号] R543.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）06-0024-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Xuefu Zhuyu Decoction on aortic plaque burden and expression levels of inflammatory factors CXCL16 and MMP-1 in atherosclerotic mice. Methods Successful modeling was confirmed by oil-red O staining after 8 weeks of high-fat chow feeding in APOE-knockout mice. Thirty mice were randomly divided into the Xuefu Zhuyu Decoction high-dose intervention group， the low-dose intervention group and the control group. The plaque area of aortic root sections in each group was measured 4 weeks later， and the expression levels of CXCL16 and MMP-1 protein and mRNA in aortic tissues were detected. Results The mean areas of atherosclerosis （AS） plaque in aortic root  of mice in the three groups were （0.047±0.019）， （0.073±0.018）， and （0.079±0.011）mm2， and the plaque area in the high-dose group was smaller than that in the low-dose group （P<0.05）， and the plaque area in the low-dose group was smaller than that in the control group （P>0.05）. The relative levels of CXCL16 protein in the three groups were （0.422±0.065）， （0.640±0.070）， and （0.849± 0.054）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative levels of MMP-1 protein were（0.260±0.031）， （0.535±0.050）， and （0.736±0.039）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of CXCL16 mRNA were （0.407±0.023）， （0.725±0.044），（0.823±0.038）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of MMP-1 mRNA were （0.392±0.034）， （0.513±0.033）， （0.668±0.046）， with statistically significant difference （P<0.001）. Conclusion Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit the expressions of CXCL16 and MMP-1 in aortic plaques of AS mice， and reduce plaque burden with high-dose intervention.

[Key words] Atherosclerosis; Xuefu Zhuyu Decoction; CXCL16; MMP-1; Mice

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种进展缓慢的心血管系统疾病。CXC型趋化因子配体16（CXC-chemokine ligand 16，CXCL16）作为清道夫受体吞噬ox-LDL，促进内皮泡沫细胞形成[1]，高表达于粥样斑块中[2]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成员MMP-1能降解粥样硬化斑块纤维帽中的Ⅰ、Ⅲ型胶原，使纤维帽变薄易破裂[3]。Macarie等[4]研究发现，MMP-1的过度表达及活化与AS斑块的不稳定性密切相关。MMP-1水平有助于评价斑块破裂的风险[5]。血府逐瘀汤由清代医家王清任在《医林改错》中提出[6]，本方主活血化瘀、宣痹通络，是中医治疗“胸痹”的经典方[7]，其与他汀类药物合用，可进一步减少颈动脉内膜厚度、减小斑块面积[8]，但血府逐瘀汤对CXCL16、MMP-1的影响尚不明确。

1 材料与方法

1.1 材料来源

①8周龄SPF级雄性APOE-/-小鼠40只，体重（20±2）g，购自上海西普尔-必凯实验动物公司，许可证号为SCXK（沪）2018-0006。血府逐瘀汤制备药材购自浙江中医药大学附属第二医院。②主要试剂：Western-blot试剂盒（美国Invitrogen公司）;逆转录试剂盒（Fermentas公司）;③CXCL16、MMP-1引物及内参由上海生工公司设计。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠造模及分组  参照文献[9]选择APOE-/-小鼠，经高脂饲养8周后，取主动脉根部组织脱水、包埋、切片，油红O染色12～15 h后，如光镜下见脂质斑块，表示AS建模成功。将30只小鼠随机分为血府逐瘀汤高剂量组、低剂量组、对照组，每组各10只。

1.2.2 血府逐瘀汤制备及给药  桃仁12 g，红花9 g，当归9 g，生地9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳壳6 g，甘草3 g，加水750 ml，浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 min，浓缩至150 ml，即含药浓度0.5 g/mL。根据小鼠给药剂量公式计算给药量[10]，每日1次，共4周。高剂量组每天给予2 ml/100 g体重灌胃，低剂量组每天给予1 ml/100 g体重灌胃，对照组不给药。

1.2.3 采集主动脉标本及组织病理观察  12周末采集主动脉标本。将心脏-主动脉整条分离，从主动脉根部以上2 mm处断开，标本均保存固定。主动脉根部组织进行脱水、石蜡包埋，切片时参考Suzuki[11]确立的方法，显微镜下见到主动脉瓣三瓣中任何一瓣的根部出现后连续切片，厚度为5 μm。油红O染色后光镜下可见红色深染脂质斑块（图1），Image J软件定量测定斑块面积。

1.2.4 CXCL16、MMP-1蛋白水平测定（Western-blot）   将主动脉组织研磨混合，每组提取1 mg， 加入裂解液处理30 min， 收集后提取上清并煮沸。上样后电泳分离、转膜、封闭，分别加入CXCL16和MMP-1的一抗，4℃冰箱避光孵育（>12 h） 。次日孵育二抗后显影成像。Image J软件分析条带测定灰度值。

1.2.5 CXCL16、MMP-1mRNA水平测定（RT-PCR）  提取主动脉组织总RNA。CXCL16上游引物5-ACTC- AGCCAGGCAATGGCAAC-3′;下游引物5′-GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC-3′;长度693 bp。MMP-1上游引物5′-CCTGAAGAATGATGGGAGGCAAG-3′;下游引物5′-GCTCTTGGCAAATCTGGCGTG-3′，长度255 bp。GAPDH上游引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′;下游引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′，长度350 bp。PCR反应条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 3 0 s，72℃ 45 s，扩增33个循环，72℃延伸10 min，电泳30 min。Image J软件测量条带灰度值。

1.3统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件处理数据，计量资料均以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有統计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠主动脉根部切片油红染色及斑块面积情况

三组小鼠主动脉根部切片油红染色照片见图1，箭头所指暗红色区域为AS斑块。Image J软件定量测定结果显示，高剂量组斑块平均面积小于低剂量组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;低剂量组斑块平均面积与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图2。

2.2 三组小鼠主动脉组织CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白水平情况比较

三组小鼠主动脉组织CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白Western-blot条带照片见封三图1。高剂量组CXCL16、MMP-1蛋白相对水平低于低剂量组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;低剂量组相对水平低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、图3。

2.3 三组小鼠主动脉组织CXCL16、MMP-1、内参GAPDH基因表达情况

三组小鼠主动脉组织CXCL16、MMP-1、GAPDH基因RT-PCR电泳照片见封三图2。高剂量组CXCL16、MMP-1基因相对表达水平低于低剂量组及对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;低剂量组相对表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、图4。

3 讨论

炎症反应在AS发生发展中起着关键性作用，贯穿于粥样硬化斑块的形成、演变以及破裂的整个病理过程。Kapoor等[12]研究发现，一些稳定性冠心病患者尽管接受了严格生活方式指导及最优化的药物治疗，内环境中的炎症及免疫反应仍然持续存在，导致疾病反复甚至进展。抗AS治疗不仅仅是降胆固醇，抗炎治疗的重要作用也越来越被重视。COLCOT研究[13]、CANTOS研究[14]均分别观察秋水仙碱、Canakinumab在急性心肌梗死中的治疗作用，均阐明了抗炎治疗可降低心肌梗死患者远期心血管事件发生风险，证实了抗炎治疗的有效性。在中医药领域，Lin等[15]体外细胞培养内皮细胞发现，血府逐瘀汤可以抑制血管内皮生长因子表达。程茂维[16]观察82例急性脑梗死患者发现，在常规他汀治疗基础上加用血府逐瘀汤可进一步降低患者胆固醇、三酰甘油水平。杨华等[17]将血府逐瘀汤加减应用于急性冠状动脉综合征患者的治疗，观察发现治疗后1年内心绞痛及心肌梗死再发率、住院率均明显下降。C反应蛋白是冠心病独立的生物标志物[18]，可呈剂量依赖性上调巨噬细胞表达及分泌CXCL16[19]。陈东等[20]报道，C反应蛋白可上调巨噬细胞表达及分泌MMP-1。同时CXCL16、MMP-1高表达于粥样斑块中，因而本研究选择CXCL16、MMP-1作为研究靶点。

本研究结果显示，APOE基因敲除小鼠经高脂饮食喂养8周后成功造模为AS小鼠，予不同浓度血府逐瘀汤干预喂养4周后，小鼠主动脉组织CXCL16及MMP-1蛋白相对水平降低，CXCL16及MMP-1mRNA相对表达水平降低。该作用在低剂量血府逐瘀汤干预后即可显现，且干预浓度越高，降低作用越明显，提示血府逐瘀汤具有抑制CXCL16、MMP-1这两种炎症因子的表达作用，从而保护内皮细胞抑制泡沫细胞形成，降低已形成斑块破裂的风险。通过对三组小鼠主动脉根部切片油红染色AS斑块面积定量测定发现，高剂量组血府逐瘀汤干预后小鼠AS斑块面积较低剂量组、对照组显著减小，但低剂量组与对照组之间并无显著差异，表明高剂量血府逐瘀汤干预AS模型后，在一定程度上减少了主动脉斑块负荷，抑制了AS的进展。

本研究存在一些不足之处，如样本量较小、研究周期短，且并未涉及具体机制、作用通道的研究。在本研究基础上可进一步扩大样本量、延长观察时间进一步评估中远期疗效，同时可探讨血府逐瘀汤抑制CXCL16及MMP-1表达的具体作用途径，旨在深入阐明血府逐瘀汤抑制AS进展的作用机制。

综上所述，血府逐瘀汤具有抑制AS小鼠主动脉组织CXCL16及MMP-1的表达作用，在高剂量干预下可降低粥样硬化血管的斑块负荷，在一定程度上延缓AS进展，为临床动脉粥样硬化性心血管疾病的中医药治疗提供理论依据。

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（收稿日期：2021-01-18）