赵 慧陈文文*朱丽萍葛 鸿

(1.青岛市中医医院(市海慈医院)内分泌科,山东 青岛 266033;2.青岛市中医医院(市海慈医院)神经外科,山东 青岛 266033)

自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)是病变部位主要发生在甲状腺的自身免疫性疾病,主要包括Grave 病(GD)和桥本甲状腺炎(hashimotos thyroiditis,HT),其发病机制复杂,涉及遗传、免疫和环境等多种因素[1-2]。 目前的研究发现,AITD 与甲状腺细胞炎症相关信号转导异常、炎症反应有关[3],而维生素D 在机体多种自身免疫性疾病中起调节免疫系统、增强固有免疫系统和抑制抑制适应性免疫系统的作用[4]。 1,25 二羟基维生素D3(1, 25-dihydroxy vitamin D3, 1, 25(OH)2D3)是维生素D 在体内的主要活性代谢产物,通过与细胞内的特异性维生素D 受体(vitamin D receptor, VDR)结合在机体骨钙代谢、细胞生长和分化中发挥重要作用[5-6]。 大量的研究表明,维生素D 与AITD 相关,缺乏维生素D 可能增加罹患AITD 的风险,但关于其对AITD 的作用机制及其对机体自身免疫情况的研究还较为缺乏[7-10]。 因此,本研究建立实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠模型,研究1,25(OH)2D3对自身免疫性甲状腺炎大鼠免疫指标及以TLR2/NF-κB 信号通路的影响,以期为自身免疫性甲状腺炎的临床治疗提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 雄性健康大鼠120 只,4 ～5 周龄,体重(200±10)g,由青岛博隆实验动物有限公司提供[SCXK(鲁)2017-0006]。 所有动物饲养于青岛市中医医院动物中心[SYXK(鲁)2018-0026]暂养,温度保持在21℃～25℃,相对湿度为50%～60%,自然光照明,自由进食进水,保持饲养环境清洁,适应性饲喂1 周后进行实验分组和造模。 所有实验动物经青岛市中医医院实验伦理委员会审核并批准(IACUC-2018-0141),实验过程遵循3R 原则。

1. 2 主要试剂与仪器

1,25(OH)2D3注射剂(江苏吴中医药集团有限公司,15 mg/mL,批号130232);完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)(美国Sigma公司);大鼠甲状腺球蛋白(mouse thyroglobulin,mTg)(上海源叶生物科技有限公司);血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、血清游离甲状腺素(free thyroxine,FT4) 及促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所);白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-10、IL-12 及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor, TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(上海广锐生物科技有限公司);甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TGAb)、甲状腺过氧化酶抗体(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)(武汉基因美生物科技有限公司);兔抗大鼠TLR2、NF-κB、MyD88、TRAF-6 抗体,β-actin 蛋白抗体(英国Abcam 公司);DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);HRP 标记羊抗兔IgG(上海拜沃生物科技有限公司);TRIzol总RNA 提取试剂(Invitrogen 公司);RNA 反转录试剂盒(日本TaKaRa 公司);SYBR Greeb PCR Master Mix 试剂盒(美国Bio-Rad 公司);RIPA 裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);超敏化学发光试剂盒(瑞士Thermo 公司);HE 染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

CX41 型光学显微镜购自日本Olympus 公司;ChemiDoc XRS 型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司;Centrifuge 5430R 低温高速离心机购自德国Eppendorf 公司;HM 340E 切片机购自赛默飞世尔(中国)有限公司;UV2100 型紫外分光光度计(日本岛津有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模

按照参考文献[11]对除对照组外的实验大鼠进行造模,对造模大鼠给予100 μg 的mTg+CFA 皮下注射,连续2 周,每周1 次,完成大鼠初次免疫;从第3～6 周,再对造模大鼠给予相同剂量的mTg+CFA皮下注射进行重复免疫,对照组大鼠给予水+CFA皮下注射,注射时间及次数与模型组一致。 第7 周取造模大鼠眶静脉血,采用ELISA 法测定血清TPOAb 水平,TPOAb＞60 IU/mL 即为造模成功。 造模过程中死亡3 只大鼠,造模成功率为97%。

1.3.2 分组及给药

将造模成功大鼠按随机数字表法分为模型组和1,25(OH)2D3低、中、高剂量组,每组15 只。 从第7 周开始对治疗组大鼠进行药物干预,低、中、高剂量组每天给予大鼠腹腔注射0.5、1.0、1.5 μg/kg 1,25(OH)2D3注射剂,对照组和模型组注射等量蒸馏水,硒酵母片对照组注射硒酵母混悬液(每天1 次),连续干预4 周。

1.3.3 HE 染色

末次给药后麻醉处死大鼠,摘取大鼠甲状腺组织,采用4%多聚甲醛溶液固定大鼠甲状腺组织1 周,经乙醇脱水、石蜡包埋、苏木精-伊红(HE)染色后切片(5 μm),光学显微镜下观察各组大鼠甲状腺组织病理结构改变,应用Image J 图像分析软件统计细胞核数和甲状腺滤泡面积。

1.3.4 大鼠血清甲状腺激素、自身免疫抗体及炎性因子检测

末次给药后麻醉大鼠,采集心脏血2 mL,离心20 min(3000 r/min),收集上清液,采用ELISA 试剂盒按操作规程检测各组大鼠血清自身免疫抗体(TGAb、TPOAb)水平及炎性因子(IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α)水平;采用RIA 法检测大鼠血清FT3、FT4 及TSH 水平。

1.3.5 RT-PCR

大鼠基因序列从美国国家生物技术中心相关数据库查询获得,通过Primer Premier 6.0 软件设计,引物序列(见表1),由上海生物工程股份有限公司合成。 取大鼠甲状腺组织并采用超声粉碎,TRIzol 提取总RNA,紫外分光光度计测定吸光度值,分析总RNA 纯度。 用反转录试剂盒合成cDNA,PCR 扩增,荧光定量PCR 仪检测mRNA 表达水平。 反应体系为30 μL(SYBR Greeb PCR Master Mix(2×)15 μL,cDNA 1 μL,Primer A、Primer B 各0.5 μL,无RNA 酶H2O 13 μL)。 定量扩增程序为:95℃预变性10 min,95℃变性15 s,60℃退火50 s,共40 个循环。 反应均以β-actin 为内参,采用2-ΔΔCt算法计算mRNA 相对表达量。

表1 TLR2/NF-κB 信号通路相关基因及内参引物序列Table 1 TLR2/NF-κB signaling pathway related genes and primer sequences

1.3.6 Western blot

取小鼠甲状腺组织,置于匀浆器中,加入RIPA细胞裂解液裂解后匀浆,低温高速离心机离心(12000 r/min,10 min),收集上清液并采用BCA 法测定蛋白浓度。 取30 μL 蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳,电转至PVDF 膜,浸入含有5%脱脂奶粉的封闭液中孵育1 h,加入适宜浓度一抗室温下封闭过夜。 次日加入辣根过氧化物酶标记二抗孵育1 h,TBST 冲洗后采用ECL 化学发光试剂盒进行检测,凝胶成像系统成像,以GAPDH 为内参,分析条带灰度值,计算小鼠TLR4、NF-κB p65 和I-κBα 蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据统计采用SPSS 21.0 软件,数据采用平均数±标准差(¯x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验,采用Graphpad 5.0 进行绘图分析,P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠甲状腺组织病理改变情况

对照组大鼠甲状腺滤泡大小适中,腔内胶质充盈,滤泡上皮细胞完整,呈低立方状;模型组滤泡变小或被破裂,滤泡上皮细胞呈高柱状,细胞核数量明显增多,胶质减少,形状不规则,细胞腔内及细胞间质可见大量炎性细胞浸润;各给药组大鼠甲状腺炎性细胞浸润减少,滤泡上皮细胞由高柱状变为立方柱状,细胞核数量减少,滤泡细胞腔内胶质增多,硒酵母片对照组小灶状改变,1,25(OH)2D3低剂量组呈小片状改变,1,25(OH)2D3中剂量组仅见散在淋巴细胞浸润,1,25(OH)2D3高剂量组呈点片状改变,见图1、表2。

注:A:对照组,大鼠甲状腺滤泡完整,大小适中,腔内胶质充盈,间质未见炎性细胞浸润;B:自身免疫性甲状腺炎模型组,大鼠甲状腺滤泡缩小或被破坏,大小不均,间质有大量炎性细胞浸润,腔内胶质减少;C:硒酵母片对照组,大鼠甲状腺滤泡结构较完整,间质炎性细胞浸润减少,胶质含量略减少;D:1,25(OH)2D3低剂量组,呈点片状改变,甲状腺滤泡大小不均,间质可见炎性细胞浸润,腔内胶质较少;E:1,25(OH)2D3中剂量组,大鼠甲状腺滤泡增大,间质少量炎性细胞浸润,腔内胶质增加;F:1,25(OH)2D3高剂量组,呈小片状改变,大鼠甲状腺滤泡结构较为完整,间质仅见散在炎性细胞浸润,胶质含量增加。

表2 各组大鼠甲状腺系数、甲状腺细胞和核数及滤泡面积比较(¯x±s,n=5)Table 2 Comparison of thyroid coefficient, number of thyroid cells and nuclei and follicular area in each group

2.2 各组大鼠甲状腺抗体和甲状腺功能比较

与对照组比较,模型组、硒酵母片对照组以及1,25(OH)2D3各剂量组TGAb、TPOAb、FT3、FT4 均增加,TSH 均降低,其中模型组与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,硒酵母片对照组和1,25(OH)2D3各剂量组TGAb、TPOAb、FT3、FT4 均降低,TSH 均增加,呈现出剂量依赖性,差异均具有统计学意义(P＜0.05),见图2。

2.3 各组大鼠血清炎性因子水平

与对照组比较,模型组大鼠血清IL-6、IL-12和TNF-α 水平显著升高(P＜0. 01),IL-10 水平显著降低(P＜0. 01);与模型组比较,硒酵母片对照组血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平显 著降低(P＜0. 01),IL-10 水 平 显 著 增 加(P＜0. 01),1,25(OH)2D3各剂量组IL-6 与模型组差异具有统计学意义(P＜0. 05),中、高剂量1,25(OH)2D3组IL-12、IL-10 及TNF-α 与模型组差异具有统计学意义(P＜0. 05),见图3。

注:与对照组相比,aP＜0.05,bP＜0.05;与模型组相比,cP＜0.05,dP＜0.05。图2 各组大鼠甲状腺抗体和甲状腺功能比较(x¯±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 2 Comparison of thyroid antibody and thyroid function of rats in each group

注:与对照组相比,aP＜0.05,bP＜0.05;与模型组相比,cP＜0.05,dP＜0.05。

2.4 各组大鼠甲状腺组织TLR2、MyD88、TRAF-6和NF-κB mRNA 表达

与对照组比较,模型组大鼠甲状腺组织中TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 表达显著均显著增加(P＜0.05)。 与模型组比较,硒酵母片对照组及1,25(OH)2D3各剂量组各指标蛋白表达均不同程度降低,硒酵母片对照组各指标蛋白mRNA 表达水平与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);1,25(OH)2D3各剂量组TRAF-6 与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05),高剂量组TLR2、中、高剂量组MyD88、NF-κB 与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05),见图4。

2.5 各组大鼠甲状腺组织TLR2、MyD88、TRAF-6和NF-κB 蛋白表达

与对照组比较,模型组大鼠甲状腺组织中TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB 蛋白表达显著均显著增加(P＜0.05)。 与模型组比较,硒酵母片对照组及1,25(OH)2D3各剂量组各指标蛋白表达均不同程度降低,硒酵母片对照组各指标蛋白表达与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);1,25(OH)2D3各剂量组TRAF-6 蛋白表达与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05),高剂量组TLR2、中、高剂量组MyD88、NF-κB 蛋白表达与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05),见图5。3 讨论

注:与对照组相比,aP＜0.05,bP＜0.05;与模型组相比,cP＜0.05,dP＜0.05。图4 各组大鼠甲状腺组织TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 表达(x¯±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 4 mRNA expression of TLR2, MyD88, TRAF-6 and NF-κB in thyroid tissue of rats in each group

注:与对照组相比,aP＜0.05,bP＜0.05;与模型组相比,cP＜0.05,dP＜0.05。图5 各组大鼠甲状腺组织TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB 蛋白表达比较(x¯±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 5 Comparison of TLR2, MyD88, TRAF-6 and NF-κB protein expression in thyroid tissue of rats in each group

甲状腺能够调节机体能量代谢速度、机体合成蛋白以及调节机体对多种激素的敏感性。 为研究1,25(OH)2D3对自身免疫性甲状腺炎大鼠的影响,本研究采用多次注射mTg+CFA 进行大鼠免疫建立自身免疫性甲状腺炎模型。 HE 染色结果显示,模型大鼠甲状腺组织被大量炎性细胞浸润,滤泡腔内胶质减少,形状不规则,提示造模成功。 模型大鼠血清水平FT3、FT4、TSH 及TGAb、TPOAb 水平显著增加,提示模型大鼠甲状腺功能减退,而1,25(OH)2D3干预后,大鼠甲状腺组织炎性细胞浸润减少,滤泡形状趋于规则,腔内胶质增加,血清水平FT3、FT4、TSH 及TGAb、TPOAb 水平不同程度降低,提示1,25(OH)2D3可有效改善自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺功能。

自身免疫性甲状腺炎属于免疫性疾病,其发病多与免疫细胞、免疫因子及其免疫相关信号通路相关[12]。 维生素D 是一种脂溶性维生素,在包括T 细胞、B 细胞和抗原呈递细胞上均有表达,1,25(OH)2D3是其活性形式,可直接导致免疫状态改变[13-14]。 维生素D 对自身免疫性疾病的影响主要体现在CD4+T 细胞的功能由1 类辅助性T 细胞(helper T cell 1, Th1)和2 类辅助性T 细胞(helper T cell 2, Th2)两条链相互拮抗保持平衡[15]。 Th1型细胞可分泌促炎性细胞因子IL-6、IL-10 和TNF-α,从而促进免疫应答[16],Th2 型细胞可分泌抗炎性细胞因子IL-10,从而抑制免疫应答[17]。 IL-6为趋化因子家族成员,具有促进T 淋巴细胞增殖和活化,促进B 细胞增殖和分泌抗体等功能[18]。 IL-12 主要由B 细胞和巨噬细胞产生,具有促进活性T细胞增殖、促进Th0 细胞向Th1 细胞分化、诱导细胞毒性T 淋巴细胞与NK 细胞的毒性并促进其分泌TNF-α、INF-γ 的作用[19]。 IL-10 可抑制活化T 淋巴细胞,减少甲状腺内CD4+和CD8+淋巴细胞数量,抑制甲状腺组织中淋巴细胞浸润[20]。 TNF-α 为促炎因子,参与机体免疫反应和炎症反应。 本研究显示,模型组大鼠血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平较正常对照组显著升高,IL-10 含量则显著降低,而1,25(OH)2D3干预后可显著降低大鼠血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平,增加血清IL-10 水平(图3)。 在维生素D 充足的情况下,1,25(OH)2D3能抑制Th1细胞分泌因子,从而降低血清IL-6、IL-10 和TNF-α水平。 王栋钢等[21]早期的研究表明,1,25(OH)2D3可下调INF-γ 水平、上调IL-10 水平,有利于恢复和维持Th1 和Th2 平衡。

TLR 是一种跨膜受体蛋白,当机体受到外源分子刺激时,TLR 与MyD88 结合,IL-1 受体相关激酶4(IRAK-4)磷酸化后与激活肿瘤坏死因子受体相关基因6(TRAF-6)相互作用,促I-κB 磷酸化降解,激活NF-κB,诱导炎症因子表达,最终导致炎症发生[22-23]。 NF-κB 是一种关键的核转录因子,可促进炎性细胞因子的表达,在免疫和炎症反应中具有重要作用[24]。 本研究结果显示,与自身免疫性甲状腺炎模型大鼠比较,1,25(OH)2D3各剂量组TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 和蛋白表达均降低。 结合炎症因子IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 的变化,表明1,25(OH)2D3能通过TLR2/NF-κB 信号通路抑制炎症因子IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 的表达,从而减轻自身免疫性甲状腺大鼠炎症反应。

综上所述,1,25(OH)2D3对自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能有一定的改善作用,并能机体自身免疫抗体水平,其机制可能与1,25(OH)2D3抑制TLR2/NF-κB 信号通路活性,从而调控IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 等炎症因子释放有关。