王龙梅孙永显张新鹃陈晓艳

(山东中医药高等专科学校,西医教学部,山东 烟台 264199)

支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的气道炎症性疾病,过去的研究认为嗜酸性粒细胞浸润是哮喘发病过程中气道炎症反应的主要原因,近些年的研究认为超过50%的哮喘以中性粒细胞浸润为主,中性粒细胞哮喘的临床表现及肺功能均较嗜酸性粒细胞哮喘更差[1-2],但关于中性粒细胞哮喘的发病机制尚不十分清楚。 有研究报道,在哮喘发病过程中,气道内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及细胞自噬均过度激活,ERS 介导细胞自噬激活、自噬标志基因Beclin-1 表达增加且LC3-I向LC3-II 转化,可能引起气道上皮损伤、增加气道反应性[3-4]。

ORMDL3 ( ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3)基因是新发现的哮喘易感基因,定位于17q21 染色体区,主要的生物学功能包括调控ERS及细胞自噬等[5-6]。 ERS 相关的信号通路包括蛋白激酶R 样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK ) 通 路、 肌 醇 酶 1 ( inositolrequiringenzyme1,IRE1) 通 路、 活 化 转 录 因 子6(activating transcription factor,ATF6) 通 路, 其 中ORMDL3 重要通过ATF6 通路实现对ERS 的调控。但ORMDL3 在中性粒细胞哮喘发病中的作用是否与ERS 介导的细胞自噬有关尚不明确。 因此,本研究将通过一系列动物实验来阐明ORMDL3 通过ERS 介导的细胞自噬在中性粒细胞哮喘发病中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物公司[SCXK(沪)2018-0006],共72 只,SPF 级,8 ～10 周龄,体重180 ～200 g。 饲养单位为山东中医药高等专科学校[SYXK(鲁)2019-0051]。 动物实验获得山东中医药高等专科学校伦理委员会批准(ktyd-2019-023),实验过程遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

脂多糖(LPS,批号L2880)、卵白蛋白(OVA,批号A5253)(Sigma 公司,美国);ORMDL3-siRNA 慢病毒、阴性对照(negative control,NC)-siRNA 慢病毒(吉凯公司,上海),滴度均为1×109TU/mL;ERS 激动剂毒胡萝卜素(批号HY-13433,MCE 公司,美国); ORMDL3 (批 号 ab211522)、 PERK (批 号ab229912)、IRE1α(批号ab37073)、ATF6 (批号ab122897)、Beclin-1(批号ab207612)、LC3(批号ab192890)一抗(Abcam 公司,美国)。

小动物肺功能仪(新行兴业科贸公司,北京);正置显微镜(Nikon 公司,日本);凝胶电泳系统(Bio-rad 公司,美国);凝胶成像系统(勤翔公司,上海)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及干预

动物实验分为两部分,第1 部分研究ORMDL3在中性粒细胞哮喘中的作用,实验动物随机分为对照组、模型组、模型+NC-siRNA 组、模型+ORMDL3-siRNA 组,后3 组进行中性粒细胞哮喘模型制备:第1、7、14 天时给予0.1 μg LPS 滴鼻、100 μg OVA 腹腔注射,第15 天起给予10 g/L OVA 雾化吸入激发、每天1 次、每次30 min、连续14 d。 模型+NC-siRNA组、模型+ORMDL3-siRNA 组在第15 天、即OVA 激发前进行干预, 分别给予NC-siRNA 慢病毒、ORMDL3-siRNA 慢病毒50 μL 经气道注入。

第2 部分研究ERS 在ORMDL3 参与中性粒细胞哮喘中的作用,实验动物随机分为溶剂对照组、模型+溶剂组、模型+NC-siRNA+溶剂组、模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组、模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组,造模方法和慢病毒注射方法同第1 部分,模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组第15 天起,给予300 ng/kg 毒胡萝卜素腹腔注射、每天1 次,其余各组给予等剂量溶剂腹腔注射、每天1 次。

1.3.2 气道功能检测

末次激发后24 h,采用小动物肺功能仪连接,测定0.2 s 用力呼气容积(FEV0.2)占用力肺活量(FVC) 的比值,FEV0.2/FVC 以及呼气峰流速(PEF)。

1.3.3 肺组织病理改变检测

完成气道功能检测后,处死大鼠并收集适量肺组织,生理盐水清洗后4%多聚甲醛固定,制作病理切片后采用HE 染色试剂盒进行实验,按照试剂盒说明书进行染色并在显微镜下观察肺组织病理改变。

1.3.4 蛋白表达水平检测

另取适量肺组织,采用组织裂解液进行匀浆、提取组织蛋白,检测蛋白浓度并取30 μg 蛋白进行实验,将蛋白样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,电泳分离不同分子量的蛋白后电转移至NC 膜,4℃孵育1 ∶ 1000 稀释的ORMDL3、PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 一抗或1 ∶2500 稀释的β-actin 一抗16 ～24 h,室温孵育1 ∶2000 稀释的二抗1 h,最后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带,根据条带吸光值、 以 β-actin 为 内 参, 计 算 ORMDL3、 PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 的表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件及Prism 6.0 进行统计学分析及制图,实验数据均为计量资料,经正态性检验符合正态分布,采用平均数±标准差(¯x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,有统计学差异的资料进一步采用LSD-t法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中性粒细胞哮喘模型大鼠肺组织中ORMDL3表达的变化及注射慢病毒敲低ORMDL3 的效果

模型组大鼠肺组织中ORMDL3 的表达水平较对照组升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 组肺组织中ORMDL3 的表达水平较模型组无明显变化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 组肺组织中ORMDL3的表达水平较模型+NC-siRNA 组降低(P＜0.05)。见图1。

注:与对照组相比,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA 组相比,#P＜0.05。

2.2 敲低ORMDL3 对中性粒细胞哮喘模型大鼠气道功能的影响

模型组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平较对照组降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平较模型组无明显变化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水 平 较 模 型+NC-siRNA 组 升 高(P＜0.05)。 见图2。

注:与对照组相比,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA 组相比,#P＜0.05。

2.3 敲低ORMDL3 对中性粒细胞哮喘模型大鼠肺组织病理改变的影响

对照组肺组织结构正常、未出现病理改变;模型组、模型+NC-siRNA 组均出现炎症细胞浸润,支气管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔变窄等病理改变;模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组大鼠的肺组织病理改变较模型+NC-siRNA+溶剂组改善;模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组大鼠的肺组织病理改变较模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组加重。 见图3。

图3 4 组大鼠肺组织病理改变的比较(HE 染色)Figure 3 Comparison of pathological changes of lung tissue among four groups (HE staining)

2.4 敲低ORMDL3 对中性粒细胞哮喘模型大鼠肺组织中ERS 标志基因表达的影响

模型组大鼠肺组织中PERK、IRE1α、ATF6的表达水平较对照组升高(P＜0. 05),模型+NCsiRNA 组肺组织中PERK、IRE1α、ATF6 的表达水平较模型组无明显变化(P＞0. 05),模型+ORMDL3-siRNA 组肺组织中ATF6 的表达水平较模型+NC-siRNA 组 降 低(P＜0. 05)、PERK 及IRE1α 的表达水平较模型+NC-siRNA 组无明显变化(P＞0. 05)。 见图4。

注:与对照组相比,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA 组相比,#P＜0.05。

2.5 敲低ORMDL3 对中性粒细胞哮喘模型大鼠肺组织中自噬标志基因表达的影响

模型组大鼠肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较对照组升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA组肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较模型组无明显变化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA组肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较模型+NC-siRNA 组降低(P＜0.05)。 见图5。

注:与对照组相比,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA 组相比,#P＜0.05。

2.6 ERS 激动剂对敲低ORMDL3 改善中性粒细胞哮喘模型大鼠气道功能的影响

模型+溶剂组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平较溶剂对照组降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 组+溶剂组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平较模型+溶剂组无变化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平较模型+NC-siRNA 组+溶剂组升高(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组大鼠的FEV0.2/FVC、 PEF 水平较模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组降低(P＜0.05)。 见图6。

注:与溶剂对照组相比,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA+溶剂组相比,#P＜0.05;与模型+ ORMDL3-siRNA+溶剂组相比,＆P＜0.05。

2.7 ERS 抑制剂对敲低ORMDL3 改善中性粒细胞哮喘模型大鼠肺组织病理改变的影响

溶剂对照组肺组织结构正常、未出现病理改变;模型+溶剂组、模型+NC-siRNA 组+溶剂组均出现炎症细胞浸润,支气管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔变窄等病理改变;模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组大鼠的肺组织病理改变较模型+NC-siRNA 组+溶剂组改善;模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组大鼠的肺组织病理改变较模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组加重。 见图7。

图7 5 组大鼠肺组织病理改变的比较(HE 染色)Figure 7 Comparison of pathological changes of lung tissue among five groups (HE staining)

2.8 ERS 抑制剂对敲低ORMDL3 抑制中性粒细胞哮喘模型小鼠肺组织自噬的影响

模型+溶剂组大鼠肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较溶剂对照组升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 组+溶剂组大鼠肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较模型+溶剂组无明显变化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组大鼠肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较模型+NC-siRNA 组+ 溶剂组降低(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激动剂组大鼠肺组织中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表达水平较模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组升高(P＜0.05)。 见图8。

注:与溶剂对照组比较,*P＜0.05;与模型+NC-siRNA+溶剂组比较,#P＜0.05;与模型+ORMDL3-siRNA+溶剂组比较,＆P＜0.05。

3 讨论

中性粒细胞哮喘是哮喘的独立亚型,临床症状重、激素治疗反应差且机制未完全阐明。 ORMDL3基因属于ORM 家族、定位于17q21 染色体区,是哮喘易感基因;该家族另两个成员分别是ORMDL1 及ORMDL2,分别定位于2q32 和12q13.2 染色体区,未见其与哮喘相关的报道。 本研究采用LPS+OVA致敏、OVA 激发的方式建立了中性粒细胞哮喘模型,模型大鼠出现了哮喘典型的气流受限、肺组织病理改变,且肺组织中ORMDL3 表达增加,表明中性粒细胞哮喘模型制备成功且ORMDL3 高表达与中性粒细胞哮喘的发病有关。 进一步在OVA 激发诱导哮喘前通过注射ORMDL3-siRNA 慢病毒的方式敲低ORMDL3 的表达,结果发现敲低ORMDL3 的表达能够改善哮喘大鼠的气道功能及肺组织病理改变,表明ORMDL3 表达增加与中性粒细胞哮喘的发病有关。

ORMDL3 具有多样的生物学功能,有研究报道ORMDL3 在脾细胞[7]、β 细胞[8]、白细胞[9]中参与ERS 的调控。 ERS 是一种病理刺激下未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集引发的未折叠蛋白反应,由PERK、 IRE1α、 ATF6 进 行 信 号 转 导, 其 中ORMDL3 主要通过ATF6 通路激活ERS。 已有研究报道,在哮喘发病过程中存在ERS 过度激活[10-12],本研究也证实模型大鼠肺组织中3 种ERS 标志基因的表达水平均明显增加,与既往文献关于ERS 与哮喘的报道一致[10-12]。 在注射慢病毒敲低ORMDL3 后,哮喘大鼠肺组织ATF6 的表达水平降低,而PERK、IRE1α 的表达水平无明显变化,表明ORMDL3 参与ERS 中ATF6 通路的调控,高表达的ORMDL3 可能通过激活ERS 的ATF6 通路参与哮喘发病,阻断ORMDL3 抑制哮喘发病过程中ERS 的ATF6 通路并起到治疗作用。

ERS 在哮喘发病过程中的作用复杂,心脑血管相关的研究证实ERS 是自噬的上游调控机制[13-14]。自噬是细胞内各种基质及细胞器通过溶酶体系统发生降解的过程,适度自噬有利于细胞在压力环境下存活,但过度激活的自噬会引起细胞损伤。 在哮喘发病过程中自噬过度激活,使用自噬抑制剂能够改善哮喘大鼠的气道功能[15-16]。 本研究在模型大鼠肺组织中检测到自噬标志基因Beclin-1 及LC3-II/LC3-I 的表达水平增加,敲低ORMDL3 后Beclin-1及LC3-II/LC3-I 的表达水平降低,表明高表达的ORMDL3 在哮喘发病过程中参与自噬的激活。 为了进一步阐明ERS 介导的细胞自噬在ORMDL3 参与中性粒细胞哮喘中的作用,本研究在敲低ORMDL3 后给予ERS 激动剂毒胡萝卜素干预,通过毒胡萝卜素激活ERS 后,敲低ORMDL3 改善气道功能、肺组织病理改变及抑制细胞自噬的作用发生逆转,表明ORMDL3 参与中性粒细胞哮喘的作用与ERS 介导的细胞自噬有关,阻断ORMDL3 抑制哮喘发病过程中ERS 介导的细胞自噬并起到治疗作用。

综上所述,在中性粒细胞哮喘的发病中,ORMDL3 参与ERS 及细胞自噬的调控,高表达的ORMDL3 通过ERS 的ATF6 通路激活细胞自噬,进而引起气流受限、肺组织病理改变。 将来;阻断ORMDL3 通过抑制ERS ATF6 通路介导的细胞自噬改善气流受限、肺组织病理改变,有望成为治疗中性粒细胞哮喘的可能靶点。