吴耀领，席晓黎，曾祥炼，吕锡斌，王和玉，王 莉

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州 遵义 563000）

酒糟是酿酒后产生的废渣，主要成分纤维素含量高达34%[1]。酒糟pH 值介于3.4～4.0[2-3]，具有高酸的特点。据2016 年数据，我国每年酒糟产量超过1亿t[4]，未经处理的酒糟排放到环境中容易造成污染。利用酒糟生产有机肥，不仅可以变废为宝，还有利于降低对环境的污染。酒糟堆肥过程中，纤维素降解缓慢一直是影响堆肥产品稳定性的重要因素[5-7]。只依靠堆肥原料中原有的微生物很难有效降解堆肥物料中的纤维素，通过在堆肥过程中添加高效纤维素降解菌剂可以有效促进纤维素降解，加快堆肥腐熟和稳定[8]。然而，近年来关于酒糟纤维素微生物降解的研究较少，兰小艳等[9]利用康宁木霉降解经过降酸处理的白酒糟中的粗纤维，纤维素降解率为25.9%；何颂捷等[10]从酒糟中筛选得到1株贝莱斯芽孢杆菌，能够使酒糟纤维素降解率达到22.1%；李永博等[11]从酒糟中筛选到1株枯草芽孢杆菌，纤维素酶活力达到25.84 U/mL。虽然上述菌株存在潜在应用价值，但是并没有关于其对酒糟高酸、高浓度乙醇等环境因素适应性的报道，尚不足指导菌株的实际应用。并且关于酒糟堆肥中的纤维素降解外源菌剂报道较少，且公开的微生物菌剂很难在较高酸度的酒糟中定植，酒糟堆肥的效果并不理想。

鉴于此，针对酒糟纤维素含量高、pH 值低等问题，拟从丢弃酒糟中筛选能够高效降解纤维素且在酒糟堆肥中可快速定植生长的菌株。并将筛选出的菌株制备成复合菌剂，添加到酒糟中进行纤维素降解和堆肥发酵试验，研究菌剂不同添加量的堆肥效果，为酒糟堆肥化生产提供菌种资源和理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 酒糟 酒糟：贵州茅台酒股份有限公司酿酒后产生的废弃酒糟（pH 值3.53、水分56.8%）；酒糟堆肥：将酒糟在开放式环境、人工翻堆条件下进行高温好氧发酵堆肥。

1.1.2 培养基 富集培养基：羧甲基纤维素钠5 g、硝酸钠1 g、十二水磷酸氢二钠1.6 g、磷酸氢二钾0.9 g、氯化钾0.5 g、七水硫酸镁0.5 g、酵母浸膏0.5 g、蛋白胨0.5 g，以去离子水补至1 L，pH值自然；LB 培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠5 g，以去离子水补至1 L，pH 值7.0；牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g，以去离子水补至1 L，pH值7.0；纤维素刚果红培养基：羧甲基纤维素钠2.0 g、七水硫酸镁0.3 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸铵2.0 g、氯化钠0.5 g、刚果红0.4 g，以去离子补至水1 L，pH值7.0；赫奇逊噬纤维素培养基：硝酸钠2.5 g、磷酸二氢钾1 g、六水氯化钙0.1 g、硫酸镁0.3 g、氯化钠0.1 g、氯化铁0.01 g，以去离子水补至1 L，pH值自然；稻草发酵培养基：硝酸钠2.5 g、磷酸二氢钾1 g、六水氯化钙0.1 g、硫酸镁0.3 g、氯化钠0.1 g、氯化铁0.01 g、稻草15 g（1 cm），以去离子水补至1 L，pH 值自然；马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g，以去离子水补至1 L，pH值自然。上述培养基为液体培养基配方，其对应的固体培养基添加2%的琼脂粉制成。所有培养基均在121 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素降解菌的初筛 取酒糟堆肥的中、高温阶段样品各10 g，放入盛有90 mL 富集培养基的三角瓶中进行富集培养。置于摇床上，120 r/min 振荡培养48 h。用无菌水将菌液逐级稀释，吸取0.1 mL稀释后的菌液均匀涂布于LB固体培养基上，30 ℃培养3～7 d。挑取优势菌株，点接于纤维素刚果红固体培养基上。将固体培养基置于电热恒温培养箱中30 ℃培养3～7 d，根据纤维素刚果红固体培养基上产生透明圈的情况以及透明圈与菌落直径比，初步判断其是否为纤维素降解菌。

1.2.2 纤维素降解菌的纤维素降解能力检测 将分离的微生物分别接种到LB 液体培养基中活化12 h。按4%接种到200 mL 含有1%滤纸条（1 cm×2 cm）的赫奇逊噬纤维素培养基中，对照培养基中不添加纤维素降解菌，60 r/min 振荡培养7 d。培养结束后80 ℃烘干至恒质量，用减重法计算滤纸失重率[12]。

1.2.3 菌种鉴定 将筛选出的高效纤维素降解菌纯化后，送往中国科学院微生物研究所进行形态学特征分析和分子生物学鉴定。提取筛选菌株的基因组DNA，并将其作为模板扩增16S rRNA 和ITS 基因片段。对扩增产物进行测序，将测序结果利用GenBank 数据库进行BLAST 比对，并使用软件MEGA 7.0构建Neighbor-Joining系统发育树。

1.2.4 不同菌株组合的纤维素降解能力检测 将筛选出的纤维素高效降解菌的单菌以及组合成的复合菌分别接种到LB液体培养基中活化12 h，再分别以10%添加量添加到以稻草为碳源的100 mL 培养基中，对照不添加纤维素高效降解菌。30 ℃、140 r/min 振荡培养12 d，用减重法计算稻草的降解率[13]。

1.2.5 复合菌剂制备 将筛选的3株高效纤维素降解菌菌株分别划线接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上，28～32 ℃培养48 h。然后分别接入500 mL 三角瓶中，在30 ℃、135 r/min下，振荡培养24 h。将上述各菌株的液体菌种以10%（v/w）接种量分别接入灭菌后的麸皮上，混匀，置于竹篓中，覆盖4 层纱布，室温培养。每天搅拌1次，培养6 d，使微生物数量达6×108cfu/g 以上。将培养所得的麸皮菌剂晾晒后按照1∶1∶1 混匀，得到复合菌剂。

1.2.6 复合菌剂堆肥试验 将复合菌剂分别以0.6%、0.8%和1.0%的接种量接种于含水56.8%的200 kg 鲜酒糟堆内，对照不添加菌剂。堆体呈圆锥体，堆体高70 cm、直径80 cm。发酵期间使用稻草对堆体加以适当覆盖，以防止空气中微生物进入。试验设置3次重复。其中，堆肥0.5 d时、1—11 d每天测定堆体温度1次；堆肥0、3、7、9 d时分别测定堆体pH值1次；堆肥0、6、12、24、30 d时分别测定堆体纤维素降解率和T值各1次。

1.2.7 指标测定 采用王和玉等[14]的方法测定温度和pH值；采用灼烧法[15-16]测定总有机碳含量；采用凯氏定氮法[17]测定总氮含量；参照于慧娟[18]的方法测定纤维素降解率。碳氮比（C/N）为总有机碳和总氮的比值；T值为堆肥终点碳氮比/堆肥初始碳氮比。

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0 对数据进行统计和分析，采用SigmaPlot 10.0绘图。

2 结果与分析

2.1 酒糟纤维素降解菌鉴定及菌株组合筛选

2.1.1 酒糟纤维素降解菌的筛选 从酒糟堆肥的中、高温期分离出8株优势菌，分别点接到纤维素刚果红固体培养基上培养。8 株菌中有6 株产生透明圈（图1）。其中，菌株MX8 透明圈与菌落直径比最大，为4.0；其次是菌株MX6、MX1、MM6、TX1；MM2的透明圈与菌落直径比最小，为1.4。

图1 菌株的透明圈与菌落直径比Fig.1 Ratio of transparent circle diameter to colony diameter of strains

2.1.2 酒糟纤维素降解菌的滤纸降解能力筛选

将分离得到的8株菌在赫奇逊噬纤维素培养基中培养7 d，滤纸条的失重率如图2 所示。其中，菌株MM2、MM6、MX8 的滤纸条失重率较高，分别为21.3%、29.2%、31.8%，说明MM2、MM6、MX8 菌株的纤维素降解能力较强。

图2 菌株作用下滤纸条的失重率Fig.2 Weight loss rate of filter paper strips under the action of strains

根据纤维素刚果红培养基和赫奇逊噬纤维素培养基的筛选结果，最终选取MM2、MM6、MX8 共3株菌为酒糟纤维素高效降解菌进行下一步试验。

2.1.3 酒糟纤维素降解菌鉴定 图3 显示，筛选的纤维素降解菌MM2、MM6 和MX8 菌株分别与宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，亲缘关系最近。结合形态学特征及分子生物学方法，菌株MM2 被鉴定为宛氏拟青霉，菌株MM6 被鉴定为烟曲霉，菌株MX8 被鉴定为地衣芽孢杆菌。

图3 基于ITS基因序列（A）和16S rRNA基因序列（B）构建的酒糟纤维素降解菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of cellulose-degrading strains based on ITS gene sequences（A）and 16S rRNA gene sequences（B）

2.1.4 酒糟纤维素降解菌的稻草降解能力分析

稻草降解试验结果如图4 所示。当菌株MM2、MM6 和MX8 单独培养时，稻草的降解率分别为19.98%、40.98%、27.36%。其中，菌株MM6 对稻草的降解率显著高于其他2个菌株。当菌株两两混合时，混合菌株对稻草的降解率均高于其相应单个株菌，MM2+MM6、MM2+MX8、MM6+MX8 对稻草的降解率分别为45.89%、36.22%、44.24%，表明MM2、MM6 和MX8 这3 株菌两两之间在稻草降解方面存在一定协同性。当3 个菌株混合培养（MM2+MM6+MX8）时，稻草降解率为42.12%。上述结果表明，3个菌株混合后的协同性虽然没有2个菌株的大，但未出现抑制效果。

图4 酒糟纤维素降解菌及其复合菌剂的稻草降解率Fig.4 Degradation rate of straw under different strain combinations

2.2 复合菌剂不同添加量对酒糟堆肥化的影响

2.2.1 复合菌剂不同添加量对酒糟堆肥化过程中温度的影响 图5 显示，复合菌剂接种量为0.8%和1.0%的堆体升温速度最快，堆置0.5 d 后开始升温，2 d后前者温度达到48 ℃。0.6%复合菌剂接种量的堆体和对照堆体分别在堆肥3 d 和7 d 时开始升温。堆肥至10 d，4 种处理堆体温度均达到最高，并开始降温，说明酒糟堆肥已经达到了无害化处理。整个堆肥过程中，对照堆体的温度低于0.6%复合菌剂接种量堆体的温度，而0.6%复合菌剂接种量堆体的温度低于0.8%和1.0%复合菌剂接种量堆体的温度，说明0.8%和1.0%复合菌剂接种量的酒糟堆肥的腐熟效果优于0.6%复合菌剂接种量和对照。0.8%和1.0%复合菌剂接种量堆体温度变化基本一致。由此判断，在酒糟堆肥过程中加入MM2、MM6、MX8的复合菌剂能够显著提高堆体的升温速度，延长高温期，有利于酒糟堆肥的腐熟，且以0.8%和1.0%复合菌剂接种量促腐效果为最好。

图5 复合菌剂不同添加量酒糟堆肥化过程中温度变化Fig.5 Variation of temperature during composting of distiller’s grains with different inoculation amount of complex microbial community

2.2.2 复合菌剂不同添加量对酒糟堆肥化过程中pH 值的影响 图6 显示，随堆肥时间的延长，堆体的pH 值逐渐升高。堆肥开始时堆体的pH 值为3.53；堆肥3 d 时，对照和添加0.6%、0.8%和1.0%复合菌剂的堆体pH 值分别上升至3.63、4.02、5.23 和6.05。表明复合菌剂能够在酒糟高酸环境中迅速定植并生长，具有较好的酸环境适应性，且随复合菌剂接种量的增加，酒糟堆肥pH值升高速度也表现为加快趋势。堆肥9 d 时，添加0.6%、0.8%和1.0%复合菌剂堆体的pH值升至6.47、6.99和7.01，已经达到堆肥腐熟的国家有机肥标准要求，即pH 值介于5.5～8.5[19]。0.8%和1.0%复合菌剂接种量降低酒糟堆肥酸度的效果优于0.6%复合菌剂接种量和对照。

图6 复合菌剂不同添加量酒糟堆肥化过程中pH值变化Fig.6 Variation of pH values during composting of distiller’s grains with different inoculation amount of complex microbial community

2.2.3 复合菌剂不同添加量对酒糟堆肥化过程中纤维素降解率的影响 图7 显示，酒糟堆肥过程中0～12 d 纤维素降解最快，12 d 后纤维素降解速度开始变缓，这与温度变化趋势相对应。0.6%复合菌剂接种量堆体和对照堆体纤维素降解率低于0.8%和1.0%复合菌剂接种量堆体的纤维素降解率。至堆肥发酵30 d，对照及0.6%、0.8%和1.0%复合菌剂添加量堆体的酒糟纤维素分别降解了18.0%、28.6%、34.8%和37.0%。0.8%和1.0%复合菌剂添加量的酒糟纤维素降解率接近，二者显著高于0.6%复合菌剂添加量和对照堆体的酒糟纤维素降解率。1.0%复合菌剂添加量堆体纤维素的降解率比对照高

图7 复合菌剂不同添加量酒糟堆肥化过程中纤维素降解率变化Fig.7 Variation of degradation rate of cellulose during composting of distiller’s grains with different inoculation amount of complex microbial community

105.6%。

2.2.4 复合菌剂不同添加量对酒糟堆肥化过程中T

值的影响 图8 表明，4 个处理在堆肥发酵前期的T值均呈现短暂上升趋势，这可能与前期微生物的大量繁殖造成氮源消耗和氮素挥发有关。随着高温期碳素大量分解，堆肥12 d 时，其T 值显著降低，而后下降速度变缓。0.8%和1.0%复合菌剂添加量堆体的酒糟T 值降低速度快于对照和0.6%复合菌剂添加量堆体的酒糟T 值。堆肥30 d 时，对照以及0.6%、0.8%和1.0%复合菌剂添加量的酒糟堆体T值分别为0.76、0.67、0.62 和0.61，添加复合菌剂的堆肥T值小于0.7[20]，达到腐熟要求。

图8 复合菌剂不同添加量酒糟堆肥发酵过程中T值变化Fig.8 Variation of T values during composting of distiller’s grains with different inoculation amount of complex microbial community

3 结论与讨论

在好氧堆肥过程中，堆肥中添加高效纤维素降解菌剂能够促进纤维素的降解，加快堆肥腐熟和稳定[21]。阳刚等[22]分离了1 株纤维素降解菌，混合发酵白酒酒糟后发现，酒糟粗纤维降低了15.23%。李国伟等[23]筛选出1 株香坊肠杆菌并发酵白酒酒糟，发现粗纤维降低37.06%，显著降低了酒糟的纤维素含量。刘青海等[24]研究了高效纤维素降解菌株复合菌剂在油菜秸秆堆肥中的应用，发现接入纤维素降解复合菌剂的纤维素降解率达到16.4%，平均C/N由28.18 下降至14.19。大部分筛选纤维素分解菌的研究强调菌剂在某一特定环境条件下的功能，并不特别关注其是否具有环境适应性。但微生物菌剂在实际使用时，容易受周围环境的影响，废弃物降解效果不佳，这也是复合微生物在生物堆肥应用中的巨大缺陷[25]。低pH 值是影响堆肥微生物菌体生长的重要因素，会严重抑制堆肥反应的进行，影响堆肥的效果[26]。朴哲等[27]发现，纤维素分解菌复合系MC1 的纤维素酶在pH 值介于4.5～10.5 时表现出较高的稳定性，但超出此范围，酶活性急剧下降直至丧失。另外，复合菌剂的环境稳定性和耐受性比单一菌株更强，对复杂环境的堆肥更有利，而具有协同性的复合菌剂对纤维素降解效果明显优于单一菌株[28]。王元明[29]筛选了2 株存在协同性的链霉菌，混合培养后发现，复合菌剂对滤纸降解效果明显优于单一菌株，对水稻和玉米秸秆的纤维素降解率比单一菌株高56.4%。因此，纤维素降解复合菌剂的筛选需要关注菌株的环境适应性和菌株间的协同性。

本研究从酒糟中筛选出高效降解纤维素的菌株MM2、MM6、MX8，经鉴定分别为宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），3 株菌均表现出较高的纤维素降解能力。此外，菌株MM2呈现出在纤维素刚果红培养基上纤维素降解能力较低、在赫奇逊噬纤维素培养基上纤维素降解能力较高的结果，这可能是因为2 种培养基中添加的纤维素不同所致。纤维素刚果红培养基中所添加纤维素为羧甲基纤维素钠，是天然纤维经过碱处理得到的改性纤维素[30]，其分子质量和交联度较小，因此，具有单一组分的纤维素降解酶即可将其降解[31]；赫奇逊噬纤维素培养基中的滤纸纤维素是天然纤维素，分子质量和交联度较高，需要微生物产生的解链因子、内切葡聚糖酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等多种因子和酶参与才能将其降解[32]。本研究中，3株菌两两之间存在一定协同性，且3 个菌株混合后未出现抑制效果。青格尔等[33]的研究表明，复合菌剂对环境的变化具有较强的缓冲调节能力。因此，为减少环境的影响，将3 个菌株组合成酒糟纤维素降解复合菌剂。

堆肥过程中温度的变化反映堆体内微生物活性的变化[34-37]，同时也是堆肥达到无害化和稳定化的重要条件[38]。丁敬[39]认为，堆体温度的高低决定着堆肥速度的快慢，可将其作为判定堆肥产品是否腐熟的指标之一。将3株菌混合制成复合菌剂用于酒糟的堆肥化试验，复合菌剂表现出较好的酸环境适应性，能够在较高酸度酒糟堆肥中快速增殖并启动堆肥发酵，显著提高堆肥的升温速度，延长高温期。魏自民等[40]认为，小分子有机酸主要存在于未腐熟的堆肥中，可以利用堆肥酸度变化来判断堆肥的腐熟度。酒糟堆肥9 d 时，添加0.6%、0.8%和1.0%复合菌剂的堆体的pH 值升至6.47、6.99 和7.01，已经达到国家有机肥标准中堆肥腐熟的酸度要求。C/N 可以反映堆肥物料的稳定性。当堆肥产品的C/N 小于20 时，即可判定堆肥产品已达腐熟[41]。但对于植物秸秆之类的固体废弃物堆肥材料来说，堆肥初始C/N 值较低，此时C/N 不能作为堆肥腐熟的判定标准[42]。MOREL等[43]建议采用T值来评价堆肥的腐熟度。腐熟堆肥的T 值应在0.53～0.70[44-45]。酒糟堆肥至发酵结束时，添加复合菌剂的堆体T值介于0.61～0.67，达到堆肥腐熟的T值要求，因此，在酒糟堆肥中加入复合菌剂有利于堆肥腐熟。此时，1.0%复合菌剂添加量酒糟堆肥纤维素的降解率比对照高105.6%。

综上，本研究从废弃酒糟中筛选制备的MM2（宛氏拟青霉）、MM6（烟曲霉）、MX8（地衣芽孢杆菌）复合菌剂对酒糟堆肥有显著的促腐熟作用，适合用于酒糟堆肥的工业化生产。