谈暠媛，胡 深，周 平，郑 强，文静静，冯超林

（湖北省兽药监察所/湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心，武汉 430070）

中国宠物相关行业发展迅速，宠物饲料营养和质量安全受到大众关注。牛磺酸是动物必须的非蛋白质含硫氨基酸，主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中［1］，具有丰富多样的生理功能，在抗氧化，免疫调节，抗细胞衰老方面有显著的功效［2］，对于宠物猫十分重要［3-6］。饲料中牛磺酸的检测方法主要是高效液相色谱法［7］，缺点是前处理需要衍生，毒性大，操作复杂，耗时，影响因素较多。本研究建立了使用氨基酸分析仪检测宠物饲料中牛磺酸含量的方法，利用了牛磺酸水溶性的特点，以水为提取液，经离子交换柱层析分离，通过茚三酮反应显色，用外标法定量检测出其含量。该方法前处理过程快速简单，不需要衍生，较为适宜猫粮中牛磺酸含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

氨基酸自动分析仪L-8900（日本日立）；AE-240电子天平（瑞士梅特勒）；高速冷冻离心机。

1.2 药品与试剂

牛磺酸标准品（CHEM SERVICE，批号8103700）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；茚三酮显色溶液（日本和光纯药株式会社）；氨基酸分析仪配套缓冲液。

1.3 标准品溶液配置

标准储备溶液的配制：精密称取牛磺酸标准品10.00 mg，用适量的水溶解，定容至10 mL 容量瓶，配成浓度为1 mg/mL 的标准储备溶液。

混合标准工作液的配制：取适量的标准储备溶液，用0.02 mol/L 盐酸溶液稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。

1.4 试验方法

1.4.1 试验条件 离子交换柱，4.6 mm×60.0 mm（填料为离子交换树脂，日立2622 sc）；反应柱，不锈钢柱（填料为石英砂，日立855-3533）。交换柱柱温57 ℃，反应柱柱温136 ℃，缓冲液流速0.4 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min。检测波长570 nm，循环时间20 min，采集时间30 min，进样量20 μL。

1.4.2 标准曲线的绘制 准确量取适量的标准储备液，分别稀释成1、2、5、10、25、50 μg/mL 的标准工作液，供仪器分析；进样量为20 μL，每个浓度重复检测2 次；取其平均峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；拟合，求标准曲线方程和相关系数。

1.4.3 样品的提取 精密称取样品约1.00 g，置于25 mL 离心管中，加适量水，加热至60 ℃，超声提取30 min，用水定容至25 mL。将样品溶液6 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，加入0.04 mol/L 盐酸溶液5 mL，混匀后过0.22 μm 滤膜。

2 结果与分析

2.1 线性关系

在浓度为1～50μg/mL，牛磺酸的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，线性方程y=240 590x+23 946，R2=0.999 8。具体见表1、图1。

图1 牛磺酸的标准曲线

表1 标准曲线的浓度与峰面积

2.2 仪器精密度

配置牛磺酸标准溶液10 μg/mL，连续6 次进样，峰面积相对标准偏差为2.65%。结果见表2、图2。

表2 精密度试验

图2 牛磺酸标准品色谱

2.3 定量限和检测限

以牛磺酸标准溶液的色谱响应值计算，当信噪比（S/N）为3 时，测得仪器的检出限为0.15 μg/mL，换算得到方法的检测限为7.5 mg/kg；当信噪比（S/N）为10 时，测得仪器的定量为0.50 μg/mL，方法的定量限为25.0 mg/kg。

2.4 回收率、精密度及空白试验

以猫粮为空白样品，分别在样品中添加牛磺酸进行回收试验，添加浓度相当于50、100、250 mg/g，每个浓度5 个平行。结果见表3、图3。可见，使用氨基酸分析仪测定猫粮中牛磺酸含量的方法较为可靠。

表3 回收率测定结果

图3 空白样品色谱

2.5 测定方法分析与验证

以本研究建立的氨基酸分析仪法测定猫粮中牛磺酸含量（方法1）与用农业部2483 号公告-5-2016饲料中牛磺酸的测定-高效液相色谱法（方法2）测定的结果相近（表4），说明使用氨基酸分析仪测定猫粮中牛磺酸的含量的方法准确可靠。

表4 样品中牛磺酸含量测定结果比较 （单位：mg/kg）

由于宠物饲料的特殊性，16 种氨基酸常和牛磺酸同时存在。试验证实见图4，牛磺酸与16 种氨基酸的混标可以互不干扰。用氨基酸分析仪测量牛磺酸的同时可以测量氨基酸的含量。通过氨基酸酸水解的方法处理宠物饲料［8］，可以提取牛磺酸。加标回收试验发现牛磺酸使用氨基酸酸水解的方法回收率比建立的用水溶解牛磺酸的方法要低。在牛磺酸含量低的样品中，本底的影响较大，导致酸水解处理方法的回收率不理想，但是在牛磺酸含量高的样品中，2 种提取方法结果相差不大，可以用酸水解法同时提取样品中牛磺酸和氨基酸，用氨基酸分析仪同时测量牛磺酸和16 种氨基酸的含量。

图4 牛磺酸和16 种氨基酸的混合标准品检测情况

3 小结与讨论

试验结果表明，氨基酸分析仪可以用于宠物饲料中牛磺酸的含量测定，该方法比高效液相色谱法测量省略了衍生的步骤，可直接进行测定，安全无毒性，减少污染，节省时间，操作简单。用氨基酸分析仪测量宠物饲料中牛磺酸的方法简单快速，在浓度为1～50 μg/mL，牛磺酸的峰面积与其浓度呈良好的线性关系。该方法丰富了宠物饲料中牛磺酸的含量测定，可为研究宠物饲料中牛磺酸的含量提供技术参考。