徐丽梅，陈炼红

(西南民族大学 食品科学与技术学院，成都 610041)

紫薯(Ipomoeabatatas)，属于旋花科，又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色[1]，有丰富的营养价值，且具有抗衰老，降血压，预防动脉硬化，改善机体功能，降低基因突变的可能性等保健作用[2-4]。人体衰老、心血管病甚至癌症等疾病的产生与恶化的主要诱因是人体内活性氧自由基(包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等)以及其代谢产物的增多[5-6]，生活中，人们摄入适量含有抗氧化剂的食品能一定程度上清除或抑制自由基化合物，减少其对人体的伤害。

多聚糖，又叫多糖，是一类维持生命所需生命有机体、不具有甜味和强还原性的天然的大分子物质，具有复杂的生物活性与功能，例如储存能量、防御功能和抗氧化性等[7-8]，还包括调节免疫力[9-11]，协助消化系统分解食物，保护肝脏[12-13]和调节肠道菌群结构等[14-15]保健作用。目前多糖的提取方法主要有酸碱提取法、超声波辅助提取法[16]、超高压辅助结合水提法和酶法等[17-18]。紫薯多糖作为植物多糖，可采用酶法提高提取效率，利用酶在适宜条件下催化水解细胞壁，从而加快多糖释放的速度。

目前国内对于紫薯多糖的研究大多集中于提取方法和对油脂以及动物为试验体的抗氧化试验。本试验则是通过对紫薯多糖的羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)和1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除能力的测定，并以相应浓度的抗坏血酸作为对照，对其抗氧化活性进行评价，将为后续相关研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

紫薯：购自河南南阳，放置在55 ℃恒温干燥箱中烘干，粉碎，过100目筛，得紫薯粉，在干燥器中保存，备用；纤维素酶(40 U/mg)、果胶酶(BR)、木瓜蛋白酶(2 U/mg)、无水乙醇、苯酚、柠檬酸、三氯乙酸、抗坏血酸、浓硫酸、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、水杨酸、过氧化氢、丙酮、硫酸亚铁、Tris-HCl、乙醚、邻苯三酚：均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TD4A台式离心机 长沙英豪仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；MP511 pH计 上海三信仪表厂；BCD-243K冰箱 河南新飞电器公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-2102C/PC/PCS紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 复合酶法提取紫薯多糖工艺

工艺流程：紫薯→前处理→溶解→调节pH→添加复合酶→酶解→灭酶→离心取上清液→除蛋白→静置→离心取上清液→醇沉→离心取沉淀→洗涤→烘干→复溶→粗多糖溶液[19-21]。

1.2.2 紫薯多糖含量的测定方法

1.2.2.1 葡萄糖溶液标准曲线的绘制

使用葡萄糖标准溶液作为标准物，采用苯酚-硫酸法[22]，于波长490 nm处测吸光度。以吸光度值OD(A)为纵坐标，葡萄糖标准溶液质量浓度(x)为横坐标，制作葡萄糖标准曲线。所得回归方程为：A=17.177x-0.0223(x为葡萄糖质量浓度(mg/mL)，A为吸光度)，R2=0.9981，线性关系良好。

1.2.2.2 多糖含量的测定

取1.0 mL粗多糖溶液置于带塞比色管中，加UP水至2.0 mL。将质量分数为5%的苯酚溶液1.0 mL及浓硫酸5.0 mL分别用1.0 mL和5.0 mL的移液管加入到带塞比色管中，10 min室温静置，摇匀，放于30 ℃恒温水浴锅中水浴20 min，取出冷却至室温，于490 nm波长处测吸光度，并计算样品中多糖得率。

式中：ω为样品中多糖得率，%；c为样液的质量浓度，mg/mL；V为定容的体积，mL；M为所取紫薯粉末重量，g。

1.2.3 复合酶法提取紫薯多糖单因素试验

在紫薯多糖提取工艺的基础上，对提取工艺中的液料比、复合酶添加量、酶解pH、酶解时间、酶解温度等因素进行工艺优化，并通过计算多糖得率确定最佳的工艺参数，具体单因素试验设计见表1。

1.2.4 Plackett-Burman试验设计筛选提取紫薯多糖关键因素

根据单因素试验确定5个影响因素复合酶添加量、酶解温度、液料比、酶解时间、酶解pH值合适的反应范围，运用Minitab 17软件进行Plackett-Burman试验设计及关键因素筛选试验[23]，试验设计见表2。

表2 Plackett-Burman试验设计的因素、水平和编码

1.2.5 响应面优化复合酶法提取紫薯多糖

在单因素试验及关键因素筛选设计试验的基础上，设置酶解温度、液料比、酶解时间、复合酶添加量为试验变量，将多糖得率设置为响应值，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，并运用Design-Expert 8.0.2 软件设计出试验组，从而开展四因素三水平响应面设计试验，并对试验结果进行数据整理和分析，得出复合酶法紫薯多糖最佳提取工艺参数[24]。其中，响应面设计因素与水平见表3。

表3 响应面设计因素与水平Table 3 The factors and levels of response surface design

1.2.6 紫薯多糖的抗氧化活性试验

运用体外抗氧化活性研究的方法，测定紫薯多糖对·OH、O2-·及DPPH·的清除能力，并在一定条件下与抗坏血酸做对比来评价紫薯多糖的抗氧化活性。

1.2.6.1 紫薯多糖对·OH清除能力的测定

分别取浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，依次加入9 mmol/L水杨酸-乙醇2 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，在37 ℃下，添加8.8 mmol/L H2O22 mL，反应时间0.5 h，以加入UP水为空白对照组，以相同质量浓度的Vc溶液作为对照，在510 nm下测量吸光度。·OH自由基清除率(Q，%)计算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0为空白组的吸光度；HX为试验组的吸光度；HX0为UP水代替H2O2溶液作为参比的吸光度。

1.2.6.2 紫薯多糖对DPPH·清除能力的测定

分别取2.0 mL浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液，依次加入2.0 mL 0.1 mmol/L 浓度DPPH溶液，混匀后暗室静置40 min，以蒸馏水作空白，用相同质量浓度的Vc溶液作为对照，在波长517 nm处测定吸光度值。DPPH·自由基清除率(Q，%)计算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0为空白组的吸光度；HX为试验组的吸光度；HX0为参比的吸光度。

1.2.6.3 紫薯多糖对O2-·清除能力的测定

分别取浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的多糖溶液，加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)，置于25 ℃恒温水浴锅中，水浴20 min，再加入0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液混匀后于25 ℃水浴中静置5 min；以蒸馏水作空白试验，以相同质量浓度的Vc溶液作为对照，测定其在325 nm处的吸光度值。O2-·清除率(Q，%)计算公式如下：

Q(%)=[1-(HX-HX0)/H0]×100%。

式中：H0为空白组的吸光度；HX为试验组的吸光度；HX0为参比的吸光度。

2 试验结果与分析

2.1 提取工艺优化单因素试验结果

2.1.1 不同液料比对紫薯多糖提取率的影响

由图1可知，当液料比在20∶1～30∶1之间时，多糖提取率随之增加而增加，超过30∶1(mL/g)时，提取率逐渐下降，即在30∶1(mL/g)处达到最大值2.701%。导致该现象的原因可能是液料比的增大，短时间达到多糖提取的平衡点；相反，当液料比过小时，所有多糖未充分溶出而呈现上升趋势。因此，由液料比单因素试验可知，将液料比设置为30∶1(mL/g)时紫薯多糖的提取效果最佳。

图1 不同液料比对紫薯多糖提取率的影响

2.1.2 不同复合酶添加量对紫薯多糖提取率的影响

由图2可知，酶的添加量低于4%时，紫薯多糖得率缓慢上升，4%时达到顶峰，为2.739%。酶的添加量超过4%时，紫薯多糖得率略下降，可能是由于酶分子过饱和，影响酶分子与底物结合。因此，通过复合酶添加量的单因素试验结果可得，若想得到紫薯多糖最佳提取率，则复合酶添加量为4%。

图2 复合酶添加量对紫薯多糖提取率的影响

2.1.3 不同酶解温度对紫薯多糖提取率的影响

由图3可知，35～45 ℃范围内，随着温度的上升，多糖得率逐渐上升；45～60 ℃范围内，多糖得率出现大幅度下降；酶解温度为45 ℃时，多糖得率最大，为2.752%。这也许是由于酶解温度过低，使多糖不能有效溶出；随着酶解温度升高，反应速度加快，酶的活性增强，多糖溶出量增大，多糖得率升高；当酶解温度高于一定范围，部分酶发生变性而失去活力，同时部分多糖可能被降解为单糖，使多糖得率随之降低。因此通过单因素试验可得，最佳酶解温度为45 ℃。

图3 酶解温度对紫薯多糖得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of polysaccharides from purple sweet potato

2.1.4 不同酶解时间对紫薯多糖提取率的影响

由图4可知，当酶解时间在0.5～1 h之间时，多糖提取率随之增加而增加，超过1.5 h时，提取率逐渐下降，即在1.5 h处达到最大值。导致该现象的原因可能是酶解时间继续延长，多糖和复合酶可能在热作用下发生分解，多糖得率降低。这可能是由于随着时间的延长，有越来越多的细胞被破坏，多糖溶出；超过1.5 h后，已经被释放出的多糖可能有部分被水解，从而导致多糖得率下降。因此，通过酶解时间单因素试验可知，将酶解时间设置为1.5 h时紫薯多糖的提取效果最佳。

图4 酶解时间对紫薯多糖提取率的影响

2.1.5 不同酶解pH对紫薯多糖提取率的影响

由图5可知，随着酶解pH值的升高，多糖的提取率也明显增加；当pH值为加入复合酶后的原液pH(5.71±0.2)时，多糖得率最大，为2.721%；之后随着pH值的进一步增加，紫薯多糖得率下降。pH值是影响酶活性的一个重要因素，pH值升高影响酶与底物的亲和力，酶的空间结构发生改变，活性遭到破坏，使得多糖提取率降低。因此，最佳酶解pH值为原液pH(5.71±0.2)。

图5 酶解pH对紫薯多糖提取率的影响

2.2 Plackett-Burman试验设计及筛选关键因素结果

采用Minitab 17软件对表2进行试验设计及结果效应评价[25]，结果见表4和表5。

表4 Plackett-Burman试验设计及响应值 Table 4 The design and response values of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman试验设计各因素效应评价Table 5 The effect evaluation of various factors of Plackett-Burman experimental design

由表5可知，影响多糖得率因素最强的是P1(液料比)，其余因素的强弱排序是P3(酶解时间)>P2(复合酶添加量)>P4(酶解温度)>P5(酶解pH)。因此，选择酶解时间、酶解温度、复合酶添加量和液料比这4个因素进一步做响应面法优化试验设计和分析。根据单因素试验，将酶解pH定在较好水平上，即酶解pH为复合酶添加后pH(5.71±0.2)进行后续试验。

2.3 响应面优化复合酶法提取紫薯多糖试验结果

由Design-Expert软件将上述4个因素分析后设计出29组试验方案，根据软件给出的试验顺序进行试验，试验方案及其结果见表6。

表6 紫薯多糖提取的响应面试验方案及结果Table 6 Response surface design scheme and experimental results of polysaccharides from purple sweet potato

续 表

2.4 响应面法分析试验数据

2.4.1 模型方程的建立与显著性检验

利用Design-Expert 8.0.2软件，通过对表6中紫薯多糖提取试验数据进行多元回归拟合，获得多糖得率对编码自变量的回归方程：

Y=2.63+0.16A+0.12B+0.040C-0.086D-0.053AB+0.018AC-0.12AD-2.500E-003BC+0.050BD+0.12CD-0.56A2-0.28B2-0.24C2-0.13D2。

(2)

对模型进行方差分析，见表7。

表7 拟合二次多项式模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model

续 表

由表7方差分析结果可知，该试验二次模型拟合性极显著(P模型<0.0001<0.001)，表明模型极显著；而粗多糖得率失拟项不显著(P模型失拟项=0.7451>0.05)，表明无失拟因素存在，此结果说明数据与模型的拟合程度较高，试验误差小，所得二次回归模型合适。对回归方程系数进行显著性检验，分析表明一次项A、B、D差异极显著(P<0.01)，即酶解温度、酶解时间和液料比对紫薯多糖得率有显著影响；交互项AD、CD差异显著(P<0.05)，即液料比和酶解温度的交互作用以及复合酶添加量和酶解温度的交互作用对紫薯多糖得率有显著影响；二次项A2、B2、C2、D2差异极显著(P<0.01)，即酶解温度的二次项、复合酶添加量的二次项、酶解时间的二次项和液料比的二次项对紫薯多糖得率有显著影响。

2.4.2 复合酶法紫薯多糖提取的响应面分析

根据Design-Expert 8.0.2软件拟合所得方程做二维等高线图和三维图来直观展示各因素的交互作用，并分析交互作用的影响程度。在二维等高线图中，若最内侧等高线为圆形，表明图中两个因素的交互作用不明显，最内侧等高线为椭圆形则表明相互影响较大[26]。得到响应面三维图及其等高线，见图6～图11。

从响应面三维图像中可直观地看出各因素对响应值的影响，图6～图11的响应面图和等高线图以及表7的拟合二次多项式模型的方差分析表明，4个因素中对紫薯多糖提取率影响最大的是液料比，影响最小的是复合酶添加量。复合酶法提取紫薯多糖的最佳提取工艺响应值最大为2.743%，此时工艺参数为酶解时间95.00 min，酶解温度43.75 ℃，复合酶添加量4.04%，液料比30.96∶1(mL/g)。

2.4.3 验证试验

为验证模型的可预测性，同时综合考虑最佳提取工艺参数下，即酶解温度43.75 ℃，酶解时间95.00 min，复合酶添加量4.04%，液料比30.96∶1(mL/g)，在操作可行的基础上，最终将复合酶法紫薯多糖最佳提取工艺条件修正为：酶解温度44 ℃，酶解时间95 min，液料比31∶1(mL/g)，复合酶添加量4%，对模型所得到的最佳工艺条件进行检验和验证。所得平均多糖得率为2.759%，与理论值2.743%相比，相对误差为0.016%，说明回归方程可以较真实地反映各因素对响应值的影响，证明运用响应面优化复合酶法提取紫薯多糖工艺的回归模型可以使用。

2.5 紫薯多糖抗氧化性试验结果

2.5.1 紫薯多糖对·OH的清除能力

由图12可知，紫薯多糖浓度越高，对·OH的清除能力越大。相同浓度抗坏血酸对羟自由基的清除率高于紫薯多糖，在0.5 mg/mL时清除率为80.1%，而紫薯多糖为59.5%。结果表明，紫薯多糖能高效去除羟自由基且浓度越高清除率越大，但效果低于同样浓度下的抗坏血酸。

图12 紫薯多糖对·OH的清除能力Fig.12 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on ·OH

2.5.2 紫薯多糖对DPPH·的清除能力

由图13可知，在浓度为0.5 mg/mL时，抗坏血酸对1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)的清除率为95.4%。而紫薯多糖对1,1-二苯基-2-苦肼基的清除率随浓度增大而逐步增强，在浓度为0.5 mg/mL时，紫薯多糖对DPPH·的清除率为61.8%。结果表明，紫薯多糖对1,1-二苯基-2-苦肼基具有一定的清除能力，但其清除效果较相同浓度下的抗坏血酸弱。

图13 紫薯多糖对DPPH·的清除能力Fig.13 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on DPPH·

2.5.3 紫薯多糖对O2-·的清除能力

由图14可知，在浓度为0.5 mg/mL时，抗坏血酸对超氧阴离子自由基(O2-·)清除率为95.3%。而紫薯多糖对超氧阴离子自由基的清除率随浓度增大而逐步增强，在浓度为0.5 mg/mL时，紫薯多糖对O2-·的清除率达到最大，为46.3%。结果表明，紫薯多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，但其清除效果较相同浓度下的抗坏血酸弱。

图14 紫薯多糖对O2-·的清除能力Fig.14 The scavenging ability of polysaccharides from purple sweet tomato on O2-·

3 结论

在复合酶配比预试验与单因素试验基础上，根据Plackett-Burman试验设计进行关键因素筛选试验，从而依据Box-Behnken中心组合试验设计原理，运用响应曲面分析法展开四因素三水平试验，得到紫薯多糖提取工艺的较优提取参数为：液料比31∶1(mL/g)，酶解时间95 min，复合酶添加量4%，酶解温度44 ℃。

经体外抗氧化活性试验，结果显示：紫薯多糖能显著清除·OH、DPPH·、O2-·，且与多糖浓度呈正相关，存在一定的抗氧化活性。本试验对紫薯多糖复合酶法的最优提取参数与抗氧化活性进行了初步探究，为紫薯多糖的深入研究奠定了基础，并为多糖开发与利用提供了一定的参考意义。