吕博威，王翠芳，霍红雁，郭佳星，张继星，张智勇，倪娜*

(1.内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028000；2.通辽市农业科学研究院，内蒙古 通辽 028015)

沙葱(AlliummongolicumRegel)为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)植物，广泛分布于我国内蒙古、甘肃、陕西等地的草原、荒漠或干旱地带。沙葱具有较强的抗病性和适应性，易栽培，在荒漠地区具有重要的生态价值[1]。目前，学术界关于沙葱的研究主要集中于沙葱的育种与栽培[2-4]、组织培养[5]、营养价值和饲用价值开发[6-7]、有效成分提取[8]等方面。沙葱作为一种营养丰富、风味鲜爽的地方特色蔬菜，深受北方消费者喜爱，在甘肃、内蒙地区已形成了多个沙葱种植基地。目前，沙葱的食用方式主要以鲜食为主，包括清炒、凉拌、拌馅儿、涮食等，因其独特的风味，还可制成腌沙葱、沙葱酱、下饭菜等调味品。

黄酮类化合物存在于所有维管植物的叶、根、茎、花和果实中，又称黄酮体、黄碱素，是植物的次生代谢产物[9]。黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、保护心脑血管和杀虫等多种生理生化活性[10-12]。作为沙葱的主要活性成分之一，黄酮在制备沙葱源功能性调味品方面起重要作用，沙葱中黄酮类化合物的研究尤为重要。植物中提取总黄酮的方法多采用乙醇浸提法、超声法和微波法，然而这些方法或浸提时间长,或提取率低,或生产造价高，均不适于规模化生产。同时，超声提取易造成分子中C-C双键断裂，导致化合物不稳定，而微波法由于设备的安全性问题可能对健康造成不利影响[13]，因此新型黄酮提取技术倍受人们关注[14]。研究表明亲水性有机物的水溶液在一定条件下可形成双水相，双水相萃取技术可以实现双相中物质的提取和分离[15]，具有提取率高,易于放大生产,对操作环境要求较低,可连续性操作,绿色环保等优点，在植物活性成分提取上具有较大的应用潜力。张丽等[16]采用聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4双水相体系萃取分离了红高粱色素，优化后的萃取率可达98.25%。曹小燕等[17]利用超声辅助乙醇-硫酸铵双水相法分离了油菜籽粕黄酮，其平均提取量为(5.53±0.03) mg/g。采用双水相体系提取沙葱总黄酮的研究尚未见报道。

本文以乙醇-K2HPO4双水相体系为基础探究沙葱总黄酮的萃取条件，采用响应面法优化主要工艺参数以提高黄酮萃取率，为沙葱的综合利用和总黄酮的产量提供了理论依据，为研发营养型调味品提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙葱干粉：实验室自制；无水乙醇、芦丁标准品、K2HPO4、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等：均为分析纯试剂。

UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 双水相相图绘制

利用Albertsson[18]的浊点滴定法测定双水相体系的组成，并绘制双水相相图。称取定量K2HPO4(ms)溶于去离子水(mw)中，利用滴定管缓慢滴加无水乙醇并振荡，直至溶液出现浑浊，记录滴加的乙醇质量(mei)，记录此时体系总质量(mi)。加入适量去离子水(mwj)，使溶液澄清，记录此时体系总质量(mj)。再次向锥形瓶中滴加无水乙醇，直至再次达到浑浊，如此反复操作，记录每次达到浑浊时乙醇和K2HPO4在系统中所占的质量分数，计算公式如下：

以乙醇质量分数为纵坐标，K2HPO4质量分数为横坐标作图，即可得一条双节线的相图。

1.3 黄酮含量测定方法

参考郭磊等[19]、王梅霖等[20]的方法并略作修改。精密称取芦丁标准品10.4 mg以95%乙醇定容，标准液浓度为0.416 mg/mL。精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL芦丁标准液，分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL，静置6 min；加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，静置6 min后加入4 mL NaOH溶液，用蒸馏水补齐至10 mL，充分振荡后静置3 min，测定吸光值(A508 nm)。以芦丁标准液浓度(mg/mL)为横坐标，以A508 nm为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为C=0.8848A-0.0052，R2=0.9926，表明0.000～0.416 mg/mL范围内线性关系良好。依据标准曲线计算待测液中的黄酮含量。

1.4 沙葱黄酮粗提液的制备及含量测定

1.4.1 粗提液制备

沙葱黄酮的粗提方法参考萨茹丽[21]的方法并略作修改。沙葱干粉中按1∶10(g/mL)的比例加入石油醚进行脱脂、脱色处理，待石油醚全部挥发后，按1∶25(g/mL)的比例加入75%乙醇后超声处理15 min，真空抽滤去残渣，滤液定容后于4 ℃冷藏。

1.4.2 双水相萃取

上述样品中按试验设计要求加入K2HPO4、无水乙醇和蒸馏水，充分振荡均匀后放入分液漏斗静置，达到相分离。

1.4.3 黄酮萃取率计算

在1.4.2中的双水相体系上下相分离并称量体积，用1.3中所述方法测量上下相液体的黄酮含量并进行计算，公式如下：

式中：m1为上相液体黄酮含量，mg；m2为下相液体黄酮含量，mg。

1.5 双水相萃取单因素试验

1.5.1 乙醇质量分数

双水相体系中乙醇质量分数分别设置为10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定沙葱粗提液质量分数为20%，K2HPO4质量分数为30%。

1.5.2 K2HPO4质量分数

将双水相体系中K2HPO4质量分数分别设置为10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定乙醇质量分数为20%，沙葱粗提液质量分数为20%。

1.5.3 沙葱粗提液质量分数

将双水相体系中沙葱粗提液质量分数分别设置为10%、14%、18%、22%、26%、30%，固定乙醇质量分数为20%，K2HPO4质量分数为30%。

1.6 响应面法优化

在单因素试验方案的基础上，利用Box-Behnken响应面设计优化黄酮提取工艺条件。以黄酮萃取率为响应值，以乙醇质量分数、K2HPO4质量分数和沙葱粗提液质量分数3个因素为自变量，各因素设置3个水平，水平编码见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.7 数据分析

利用Origin 2019绘图，并运用Design Expert 11软件对数据进行分析、优化、模型建立与检验。

2 结果与分析

2.1 双水相相图

乙醇-K2HPO4双水相相图见图1，以曲线为界，下方为单相区，上方为两相区。当选取偏离临界点(即曲线上的点)的适宜数值时，易于形成双水相体系[22]。通过调整乙醇、水和K2HPO4的添加量同时记录上下相质量的变化发现：固定乙醇质量时，下相体积随着K2HPO4添加量的增多而增大，直至饱和；而固定乙醇和盐的质量时，水必须维持在适宜的范围内，否则将不能形成双水相或过早进入饱和状态；当K2HPO4溶液质量被固定时，加入过量的乙醇会造成K2HPO4无法溶解，过少则不能形成双水相。

图1 双水相相图Fig.1 Aqueous two-phase system diagram

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇质量分数

乙醇质量分数对黄酮萃取率的影响见图2。

图2 乙醇质量分数对沙葱总黄酮萃取率的影响Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

由图2可知，当乙醇质量分数低于20%时，随着乙醇质量分数的增加，沙葱中总黄酮的萃取率逐渐升高，当乙醇质量分数达到20%时，萃取率达到峰值，而后乙醇质量分数继续增加时萃取率下降。这是因为黄酮苷具有亲水作用，乙醇作为一种极性溶液，过高或过低浓度的乙醇不利于沙葱总黄酮的溶解[23]。当乙醇浓度较低(低于20%)时，随着上相中乙醇质量的增加，体系分相能力也逐渐增强，而黄酮在乙醇中的溶解度较在水中时大，因此其萃取率增加；而当乙醇质量分数过高(大于20%)时，溶液的极性降低，而此时其他有机物的溶出量增加，从而抑制了黄酮的萃取。因此，乙醇的最佳质量分数选择20%。

2.2.2 K2HPO4质量分数

由图3可知，当乙醇浓度和沙葱粗提液浓度一定时，黄酮的萃取率随着K2HPO4质量分数的增加而升高，当K2HPO4质量分数达到25%时，黄酮萃取率最高，而后萃取率随之下降。分析其萃取率下降的原因可能是出现了盐溶液过饱和现象。双水相体系中无机盐类物质的添加可以改变两相中成相物质的组成，当加入K2HPO4质量过多时，双水相体系中盐溶液过饱和导致盐析现象的出现，沙葱黄酮随着盐从体系中一起沉淀出来，从而导致黄酮萃取率下降。

图3 K2HPO4质量分数对沙葱总黄酮萃取率的影响Fig.3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.2.3 沙葱溶液质量分数

由图4可知，在乙醇和K2HPO4质量分数一定时，黄酮萃取率随着沙葱粗提液质量分数的增加而升高，当沙葱粗提液质量分数达到18%时，黄酮萃取率达到最大值，而后继续添加粗提液时黄酮萃取率基本保持不变。从节约材料方面考虑，确定最佳沙葱粗提液质量分数为18%。

图4 沙葱粗提液质量分数对沙葱总黄酮萃取率的影响Fig.4 Effect of the mass fraction of Allium mongolicum Regel crude extracts on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.3 响应面法优化及分析

2.3.1 响应面法优化设计及结果

运用Design-Expert 8.0软件的Box-Behnken试验设计方案，在乙醇-K2HPO4双水相体系的基础上，对乙醇质量分数(A)、K2HPO4质量分数(B)、沙葱粗提液质量分数(C)设计三因素三水平试验，方案及结果见表2。

表2 试验设计与结果Table 2 The test design and results

续 表

2.3.2 模型拟合

以总黄酮萃取率(R1)为响应值，得到回归方程R1=97.40+3.65A+2.60B+0.68C-1.96AB +0.97AC-0.33BC-4.63A2-4.93B2-2.85C2，并进行方差分析，见表3。

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

该模型显著性良好(P<0.01)，失拟项的P=0.107>0.05，不显著，说明该模型成立。R2用来代表回归方程的可靠性，R2值越接近1，方程的可靠性越高，该模型的回归方程的决定系数R2=0.9898，校正决定系数RAdj2=0.9766，R2和RAdj2数值较高且接近，说明模型具有较高的准确性和通用性，变异系数值C.V.=0.88%<10.00%，可以用此回归方程来预测沙葱总黄酮的最佳萃取工艺条件。模型的交互项AC、BC差异不显著(P>0.05)，一次项C、交互项AB、二次项C2对沙葱总黄酮萃取量具有显著影响(P<0.05)，一次项A、B以及二次项A2、B2对沙葱总黄酮萃取量均有极显著的影响(P<0.01)。通过F值可以看出各因素对沙葱总黄酮萃取率的影响程度，其顺序依次为：乙醇质量分数(A)>K2HPO4质量分数(B)>沙葱粗提液质量分数(C)。

2.3.3 响应面图分析

乙醇质量分数和K2HPO4质量分数、乙醇质量分数和沙葱粗提液质量分数、K2HPO4质量分数和沙葱粗提液质量分数对沙葱总黄酮萃取率的交互影响见图5～图7。由图可以直观地看出沙葱总黄酮萃取率在试验范围内都有最大值，说明因素水平选择范围合理，趋势明朗，能明显反映出各因素对沙葱总黄酮萃取率的影响[24-25]。响应面曲线中，等高线为圆形表示因素之间的交互作用不强，为鞍形或椭圆形则表示因素之间的交互作用较强[26]。

由图5～图7可知，在交互作用的影响下，沙葱总黄酮萃取率的变化趋势相似，即先增加后减少。由图5可知，乙醇质量分数和K2HPO4质量分数的交互作用对沙葱总黄酮萃取率存在显著影响。图6中交互作用对萃取率的影响与图5相似，随着乙醇质量分数和沙葱粗提液质量分数的增加，总黄酮萃取率呈先增加后减少的趋势，乙醇质量分数对其影响更大，表现为响应曲面更为陡峭，等高曲线更为密集[27]。由图7可知，K2HPO4质量分数和沙葱粗提液质量分数的交互作用对沙葱总黄酮萃取率的影响不显著，这与表3中的P值分析一致。

2.3.4 最佳提取条件的确定及验证

通过软件对二次多项式回归方程进行分析预测，沙葱-K2HPO4双水相萃取沙葱总黄酮最佳工艺条件为乙醇质量分数23.68%，K2HPO4质量分数25.93%，沙葱粗提液质量分数19.79%。结合实际操作情况，将其最佳工艺条件修正为乙醇质量分数24%，K2HPO4溶液质量分数26%，沙葱粗提液质量分数20%，在此条件下对建立的模型开展验证试验，设置3组平行试验，获得的沙葱总黄酮实际萃取率为(98.13±0.20)%，理论预测值为98.36%，预测误差不足1%，证实了预测模型准确可靠，具有实际应用价值。

3 结论

采用乙醇-K2HPO4双水相体系萃取沙葱总黄酮，先后利用了单因素试验和响应曲面分析构建了沙葱总黄酮萃取率与萃取条件的二次多项式模型，得到了沙葱黄酮的最佳萃取参数，同时验证试验表明该模型拟合度较好。双水相法萃取沙葱总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇质量分数24%，K2HPO4质量分数26%，沙葱粗提液质量分数20%，总黄酮萃取率可达(98.13±0.20)%。双水相萃取法具有萃取率高、成本低廉、简单易行、绿色安全等优势，作为高效萃取沙葱总黄酮的新方法，可为实际生产提供理论依据。