惠靖茹，程洋洋，黄占旺

(江西农业大学 食品科学与工程学院,江西省天然产物与功能食品重点实验室，南昌 330045)

茶树菇(Agrocybeaegerita)，又名茶新菇，是一种药食两用的真菌[1-2]。口感脆嫩清香，味道鲜美[3]；营养极其丰富，其蛋白质含量高达29.5%，含有多种人体必需氨基酸，以及多种B族维生素和矿物质元素[4-5]。此外，茶树菇具有抗衰老[6]，免疫调节及抗肿瘤[7]，改善心脑血管功能[8]等天然优势。目前茶树菇主要分布在我国的福建、江西等地，江西省种植的茶树菇产量在全国位居前列，但当地食用菌的加工技术不够成熟，大多为产品单一且附加值低的初级加工产品[9]。因此，利用茶树菇和成曲发酵制成具有丰富营养物质、口感鲜美的调味料，不仅可以提高茶树菇的利用率而且使其深加工产品种类更加丰富。

米曲霉As3.042属于黄曲霉群，菌落生长快，产孢能力强，可以更好适应环境，是传统酿造食品级酱料和酱油的生产菌种[10-11]。由于米曲霉As3.042是一种产复合酶的菌种[12]，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等[13]，其较高的酶活力可以更好地分解原料，且在一定程度上提高了酱类产品中的氨基酸态氮含量，进而更好地改善终产品的风味、色泽和口感[14]。

本文以米曲霉As3.042作为菌种，以糯米粉和黄豆粉作为菌种的营养物质并通过恒温恒湿培养得到成曲。以蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力作为评价指标进行单因素试验，对在制曲过程中的显著影响因素即原料质量比、润水量和培养时间，依据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以成曲中蛋白酶活力为响应值进行优化试验，得到最佳的制曲工艺，并对试验结果进行了验证。

1 材料与方法

1.1 材料

米曲霉As3.042：济宁玉园生物科技有限公司；糯米：江西抚州荆公农产品合作社；黄豆：赣州康瑞农产品有限公司。

1.2 试剂

干酪素(生物试剂)、3,5-二硝基水杨酸试剂(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、福林酚：均为分析纯，北京索莱宝科技有限公司；可溶性淀粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、葡萄糖：均为分析纯，西陇化工股份有限公司；羧甲基纤维素钠(化学纯)：上海展云化工有限公司。

1.3 仪器与设备

SPX-250B-Z型生化培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、SHZ-C水浴恒温振荡器 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 扬州市三发电子有限公司；FA2004G电子天平 常州万泰太平仪器有限公司；酶标仪 Molecular Devices Corporation。

1.4 试验方法

1.4.1 制曲工艺流程

糯米、黄豆→粉碎→过筛→干蒸→冷却→接种→加入凉开水→拌匀→培养→成曲。

将原料粉碎过筛，置于蒸锅中干蒸后，待糯米粉与黄豆粉于室温下冷却至40 ℃以下时，按照一定比例混合后接种米曲霉As3.042，拌匀。再加入一定量的凉开水拌匀后，置于托盘中压平，切分成2 cm大小的方块状。放置霉菌培养箱中恒温培养，平均每间隔12 h翻曲1次，利于米曲霉As3.042均匀生长进而提高成曲品质，直至制曲结束。

1.4.2 单因素试验

设置原料质量比(糯米粉∶黄豆粉)、接种量、润水量、培养时间和培养温度5个影响因素，不同原料质量比(糯米粉的含量在原料总量中的占比为20%、40%、60%、80%、100%，即糯米粉∶黄豆粉为1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)、不同米曲霉接种量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)、不同润水量(加水量在原料总量中的占比为35%、45%、55%、65%、75%)、不同培养时间(24，36，48，60，72 h)、不同培养温度(22，26，30，34，38 ℃)。依据1.4.1中的工艺流程进行制曲后，再将其置于电热鼓风干燥箱中干燥，以成曲中的蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力的大小为评价指标，考察以上5个因素对制曲过程的影响，确定单因素的最佳取值范围。每个试验平行进行3次，取其测量结果的平均值。

1.4.3 响应面优化试验设计

培养成曲所需原料的总质量固定不变，原料质量比即糯米粉与黄豆粉的质量比，随着糯米粉添加量的增多或减少，黄豆粉相应地减少或增多。因此在响应面试验中，将原料质量比因素改为糯米粉添加量，通过单因素试验所筛选的条件，选择糯米粉添加量(A)、润水量(B)、培养时间(C)3个因素为影响因素，每个因素设置3个水平，以蛋白酶活力为响应值，使用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化并确定最佳制曲工艺条件。试验因素与水平见表1。

表1 响应面优化试验因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface optimization test

1.4.4 酶活力测定方法

中性蛋白酶活力的测定：参照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》中的福林酚法；水分含量的测定：采用国标GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的常压干燥法；淀粉酶活力和纤维素酶活力的测定：参考王海洋等[15]的方法。

1.4.5 数据分析

试验数据的统计与分析采用SPSS 25.0软件，响应面试验设计、优化分析采用Design-Expert 8.0.6软件，绘图处理采用OriginPro 2018软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 原料质量比对成曲中酶活力的影响

以糯米粉作为淀粉质原料，可为制曲时微生物的生长提供碳源，同时将黄豆粉作为蛋白质原料，为制曲过程中微生物的生长提供氮源。当具有充足的碳源和氮源时，微生物会迅速生长繁殖，代谢产物大大增加[16]。

图1 原料质量比对3种酶活力的影响Fig.1 The effect of raw material mass ratio on the activity of three enzymes

由图1可知，淀粉酶活力在原料质量比为2∶3时达到最大值，为255.95 U/g。而原料质量比为3∶2时，蛋白酶活力和纤维素酶活力均达到最大值，分别是4834.787, 17.1274 U/g。综合考虑，选择原料质量比(糯米粉∶黄豆粉)3∶2为最佳水平。

2.1.2 接种量对成曲中酶活力的影响

当接种量过小时，米曲霉对底物即原料利用不充分，导致酶活力较低；而随着接种量的增加，原料中可利用的营养物质不足以满足米曲霉自身生长需要，使得其中部分微生物由于养分不足而生长缓慢，并影响了最终菌种孢子的成熟，其蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶系的分泌量也随之减少，进而导致其酶活力降低[17]。王莹[18]通过对米曲霉As3.042在酱油酿造中的性能检测，发现米曲霉As3.042具有较高的蛋白酶活力，可以更好分解蛋白质含量较多的原料，且采用米曲霉As3.042制曲时，其中的酯类物质含量较高，酱油的酯香浓郁，香气绵长飘逸。

由图2可知，当接种量为0.3%时，米曲霉生长所需的碳源和氮源充足，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力均达到最大值，分别为4979.43, 244.87, 14.75 U/g。所以，接种量的最佳条件为0.3%。

图2 米曲霉接种量对3种酶活力的影响Fig.2 The effect of Aspergillus oryzae inoculation amount on the activity of three enzymes

2.1.3 润水量对成曲中酶活力的影响

在微生物的生长过程中，水不仅直接参与微生物的代谢反应，还作为介质存在其中。米曲霉通过孢子繁殖，而孢子在生长过程中需要吸入一定量的水分使其膨胀，有利于加快米曲霉的生长速度。此外，微生物代谢产物溶解到水中，才能通过细胞表面释放出来。同时，当基质水分含量过高时，会造成基质缺氧，不利于米曲霉生长[19]。

由图3可知，随着润水量的增加，3种酶活力呈现先增后减的趋势。当润水量达到55%时，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力均达到最大值，分别为4696.97, 218.95, 20.10 U/g。因此，选择55%为最佳润水量。

图3 润水量对3种酶活力的影响Fig.3 The effect of water quantity on the activity of three enzymes

2.1.4 培养温度对成曲中酶活力的影响

成曲中的酶活力具有高度的温度依赖性。低温对酶具有钝化作用，会减缓微生物的生长及产物的代谢，降低酶活力；当温度超过38 ℃时，3种酶活力都趋于平缓，这是因为温度过高不利于微生物的生长及代谢，甚至会导致酶失活。因此在制曲过程中，对培养温度的选择尤为重要[20]。

由图4可知，当温度达到30 ℃时，蛋白酶活力和纤维素酶活力均达到最大值，分别为4624.95, 14.00 U/g；而在34 ℃时，淀粉酶活力达到最大值，为247.70 U/g。综合考虑，选择30 ℃为最佳培养条件。

图4 培养温度对3种酶活力的影响Fig.4 The effect of cultivation temperature on the activity of three enzymes

2.1.5 培养时间对成曲中酶活力的影响

制曲时间对成曲的品质有较大影响。当制曲时间较短时，微生物不能充分生长，酶活力较小，成曲的风味不足；而制曲时间过长，微生物进入衰亡期，会使其他杂菌生长，导致成曲中酶活力减小，影响发酵阶段的产品品质[21]。

由图5可知，当培养时间达到48 h时，成曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和纤维素酶活力均达到最大值，分别为4668.38, 217.30, 12.67 U/g。因此，以48 h作为最佳培养时间。

图5 培养时间对3种酶活力的影响Fig.5 The effect of cultivation time on the activity of three enzymes

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

综合单因素试验结果，固定米曲霉接种量0.3%、培养温度30 ℃，筛选出对制曲过程影响较大的3个因素，即原料质量比(A)、润水量(B)和培养时间(C)，以蛋白酶活力(Y)为响应值，进行响应面优化试验，设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface test design and results

根据Box-Behnken中心复合设计原理，建立回归方程预测模型，对响应面试验的结果进行多元线性回归和二项拟合分析，得到回归方程为： Y=5048.60+846.74A-363.33B-1.21C+48.35AB+27.79AC+44.41BC-1396.00A2-812.27B2-881.92C2。

2.2.2 模型方差分析

利用软件Design-Expert 8.0.6建立模型，得到蛋白酶活力的多元二次回归响应面模型，对试验结果进行多元线性回归和二项拟合分析，以验证回归模型与因素的显著性。方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 The variance analysis of regression model

由表3可知，建立的回归模型中F=72.01，P<0.0001，表明回归模型的差异极显著；而失拟项的P为0.5825>0.05，模型差异不显著，表明该方程可靠；回归系数R2=98.93%>85%，说明该方程拟合程度好，可用该回归方程代替试验真实点，来描述各变量与响应值之间的关系。校正系数RAdj2=0.9756，说明该模型可解释97.56%蛋白酶活力的变化。表3中数据表明试验设计可靠，误差小，适合实际情况，可用来对茶树菇发酵调味料的制曲试验结果进行分析和预测。

由表3中P值可知,一次项中原料质量比(A)和润水量(B)对蛋白酶活力的影响极显著，培养时间(C)的影响不显著；二次项中A2、B2和C2对蛋白酶活力的影响均为极显著；交互项中AB、AC、BC对蛋白酶活力的影响均为不显著。参照表3中F值的大小可得出结论：3个因素对成曲中蛋白酶活力的影响程度为原料质量比(A)>润水量(B)>培养时间(C)。

2.2.3 各因素交互作用的响应面图与等高线图

响应曲面图可以直观地体现两变量对因变量的影响情况，其坡度越陡峭，说明该试验中的因变量对响应值的影响越大，若曲面坡度越平缓，则影响越小；等高线图呈椭圆形时，表明两变量之间的交互作用越显著，若等高线图趋近圆形，则两变量的交互作用几乎可忽略[22]。利用响应面回归模型创建的原料质量比、润水量、培养时间的交互效应响应面图及等高线图见图6。

a1

将其中一个因素固定，考察其他2个因素对响应值的影响。由图6中a1和a2可知，在固定因素培养时间(C)的情况下，随着糯米粉添加量和润水量的提高，蛋白酶活力呈先升高后降低的趋势。在糯米粉含量为58.4%～73.9%，润水量为47.8%～57.9%时，蛋白酶活力在较高范围内。由图6中b1和b2可知，在固定因素润水量(B)的情况下，随着糯米粉添加量和培养时间的增加，蛋白酶活力呈先升高后降低的趋势。在糯米粉添加量为59.3%～73.2%，培养时间为42.7～53.3 h时，蛋白酶活力处于较高水平。由图6中c1和c2可知，在固定因素糯米粉添加量(A)的情况下，随着润水量和培养时间的增加，蛋白酶活力亦是先升高后降低的趋势。在润水量为49.7%～55.8%，培养时间为44.4～51.5 h时，蛋白酶活力较高。

2.2.4 验证试验

对回归拟合方程进行求解，得出最佳制曲条件：A=66.13，B=52.85，C=47.98，此条件下，预测蛋白酶活力为5219.89 U/g。根据试验和实际操作可行性，调整修正后的茶树菇调味料制曲条件：糯米粉为66%，即原料比(糯米粉∶黄豆粉)为3.3∶1.7，接种量为0.3%，润水量为52.9%，培养时间为48 h，培养温度为30 ℃。

在此条件下进行验证试验，得到茶树菇调味料成曲的蛋白酶活力为5118.16 U/g，同模型预测值的相对误差仅为1.95%(<5%)，说明响应面法对茶树菇调味料制曲的工艺条件优化所得到的生产工艺参数准确可靠，具有一定应用价值。

3 结论

调味料的科学调味营养化、多样化和高档化是未来调味料发展的趋势。以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纤维素酶活力的大小为指标，通过单因素试验，在所得结果的基础上，采用响应面法优化确定了茶树菇发酵调味料的最优制曲工艺：原料质量比(黄豆粉∶糯米粉)为3.3∶1.7，接种量为0.3%，润水量为52.9%，培养温度为30 ℃，培养时间为48 h。在该条件下所制得成曲中的蛋白酶活力为5118.16 U/g，酶系含量较高，将其切为2 cm大小的方块状，表面与切面均长满黄绿色孢子，具有成曲特殊的清香味，无杂菌生长。本研究可为用成曲与茶树菇为原料制备发酵调味料的工艺研究提供一定的理论基础，同时对发酵过程中相关理化指标的检测提供了科学的试验依据。