李跃华，周宁，宁月宝

(内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010)

我国生姜资源丰富，市场供求关系稳定[1]。生姜不仅具有维持人体健康所必需的营养素，还富含其他多种成分，如姜辣素﹑黄酮类、萜类、糖苷、甘油及微量矿物质等。生姜的有效成分除用于制成强心剂、抗肿瘤剂、防晕剂和抗过敏制剂外，在保健方面也有应用，如制成戒烟剂、口腔卫生制剂、脱毛剂等[2]，其对某些细菌尤其对沙门氏菌具有很强的抑制作用[3]。生姜辛辣风味的主要来源及主要活性成分——姜辣素，是一种非挥发性的油性液体，其在镇痛、抗炎、抑菌、抗癌、止吐以及抗氧化等方面的效果显著[4]，且在姜皮中含量较多，可以变废为宝，带来更大的社会效益[5]。黑姜，是以新鲜姜为原料，在一定温度和湿度条件下发酵而成的一种姜制品，在加工过程中，黑姜自身的组织遭到破坏，其物质发生一系列化学反应，经发酵后，成分和功能上都发生了一些变化，营养成分和更强的生理活性更加丰富[6]。本文对发酵后的黑姜多糖进行提取，测量多糖含量，用四氧嘧啶诱导小鼠复成糖尿病小鼠，分为高血糖组、中高血糖组，并对糖尿病小鼠进行黑姜多糖灌胃。目前，国内外对黑姜多糖降血糖作用鲜有报道，本文通过提取黑姜多糖及对糖尿病小鼠的影响，为以后研究黑姜提供了理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

新鲜生姜：购于包头市友谊菜市场；昆明小鼠(体重26～60 g，雄性)：购于内蒙古包头医学院。

生理盐水：吉林省都邦药业股份有限公司；四氧嘧啶：博美生物科技有限责任公司；正丁醇：天津市大茂化学试剂厂；三氯甲烷：天津市北方天医化学试剂厂；无水乙醇：天津水晟精细化工有限公司；安稳血糖仪、血糖试条：三诺生物传感股份有限公司；葡萄糖：天津市化学试剂三厂；蒽酮：上海科丰试剂厂；硫酸：北京化工厂。

1.2 仪器

XMTD-204型数显恒温水浴锅 常州诺海电子有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司；RE52CS-1型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；BCD-240SDPN型医用冰箱 青岛海尔股份有限公司；BPS-100CL恒温恒湿发酵箱 上海一恒科学仪器有限公司；SORVALL LYNX 4000高速冷冻离心机 Thermo Fisher Scientific公司；紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SQP型分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；一次性无菌注射器 莲花医疗用品有限公司；Grant XB70型制冰机；HZQ-QG型全温振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

2 实验方法

2.1 黑姜的制备

把新鲜生姜表面的杂质灰尘用清水清洗干净，再将生姜放入恒温恒湿发酵箱中，设置发酵温度65 ℃，湿度95%，发酵30 d，同时记录每天发酵箱的温度及湿度，等生姜颜色变黑，刺激性气味减少后即可取出，得到成品黑姜[7]。

2.2 黑姜粗多糖的提取

在50 ℃烘箱中放入发酵完成的黑姜，干燥2周后取出，再将黑干姜磨成细粉，使其能够通过60目筛子，得到最终黑色姜粉。

称量20 g姜粉于500 mL烧瓶中，再加入500 mL超纯水，放入70 ℃水浴锅内水浴2 h，再进行离心，4000 r/min离心20 min，去除提取液中的黑姜粉末，保留上清液体，得到黑姜水提取液，把3次的提取液合并在一起[8]。

将提取液移至旋转蒸发仪中减压蒸发，浓缩至1/4体积；将提取液放入旋转蒸发仪中蒸发，待烧瓶中液体浓缩至1/4体积时，关闭。

使用Sevage法除去黑姜水提液中的蛋白质(Sevage法：正丁醇与三氯甲烷按体积比为4∶1配制溶液，以浓缩提取液的1/5体积加入浓缩提取液中)。

在黑姜水中加入4倍体积的无水乙醇，室温静置12 h。

放入离心机，4000 r/min离心10 min，倒掉上清液，取出沉淀，再用无水乙醇、乙醚与丙酮各清洗沉淀2次，放在50 ℃烘箱中干燥12 h[9-10]。

将沉淀放入50 ℃烘箱中，干燥12 h后取出沉淀，放在研钵中研磨成粉末，即可获得黑姜粗多糖粉末[11]。

2.3 黑姜多糖含量的测定

蒽酮硫酸法：100 mL 80%硫酸溶液加0.1 g蒽酮配制溶液，按表1加样测定葡萄糖标准曲线和黑姜多糖样液吸光度[12]。

表1 蒽酮硫酸法加样Table 1 Adding samples by anthrone sulfuric acid method

2.4 动物实验

2.4.1 建立小鼠高血糖模型

2.4.1.1 实验动物分组

把小鼠随机分成两组，对照组10只，实验组20只。

2.4.1.2 小鼠称重

用电子天平称得30只小鼠平均体重约为38 g。

2.4.1.3 配制2%的四氧嘧啶溶液

使用四氧嘧啶溶液时，要注意现用现配且在避光条件下，实验需要配制2%的四氧嘧啶溶液，称量1.300 g四氧嘧啶，放置于棕色瓶中，向瓶中加入生理盐水65 mL，用玻璃棒进行搅拌，使其充分溶解，即完成四氧嘧啶溶液的配制。

2.4.1.4 腹腔注射

使实验组小鼠与对照组小鼠处于同一避光环境中，在给小鼠注射药剂时，让所有小鼠禁食不禁水12 h，实验组小鼠腹腔注射20 mg/kg 2%的四氧嘧啶溶液，再给对照组小鼠注射同样剂量的20 mg/kg生理盐水，完成腹腔注射过程。

2.4.1.5 测量并记录小鼠血糖值

所有小鼠72 h腹腔注射后，让小鼠禁食不禁水12 h，此时测量小鼠的空腹血糖值。为方便测量血糖，可将烧杯倒扣于小鼠，将小鼠尾巴经杯口暴露在烧杯外，再用手压住烧杯底部，防止小鼠乱移动，再进行采血，用采血针刺破露出烧杯口的小鼠尾端，用手顺着尾巴将血挤压出，吸入到血糖试纸中，采血完成后，用酒精将取血处进行擦拭消毒。

2.4.1.6 糖尿病小鼠分组

测量小鼠血糖值，血糖浓度值小于7.0 mmol/L为建模失败的小鼠，需进行重新建模，重复2.4.1.3～2.4.1.5的步骤，当测得的血糖浓度值大于7.0 mmol/L时为建模成功的高血糖小鼠，把建模成功的小鼠进行随机分组，分为高血糖模型对照组以及黑姜多糖组，再把归到黑姜多糖组的小鼠进行分组，测得血糖浓度值在7.0～17.0 mmol/L区间的小鼠为中高血糖组，血糖浓度值测得在17.0 mmol/L以上的小鼠为高血糖组[13]。

2.4.2 黑姜多糖灌胃

对照组、实验组的小鼠进行同步灌胃，剂量为400 mg/(kg·d)，持续灌胃4周，共计28 d。每只小鼠灌胃黑姜多糖的量约为1 mL，小鼠的个体差异随体重波动。

2.5 数据分析

采用SPSS 19.0分析数据，计算显著性检验P值。

3 结果

3.1 蒽酮硫酸法绘制标准曲线

根据所测吸光度(见表2)，绘制标准曲线。

表2 所测吸光度Table 2 The measured absorbance values

根据上述步骤和数据绘制标准曲线，见图1。

图1 标准曲线Fig.1 The standard curve

由图1可知，趋势线方程y=5.635x+0.0593，当OD625 nm值在0.1～0.5之间时，该曲线与趋势线的契合度最高。

3.2 黑姜多糖含量的测定

由于黑姜多糖在市面上并无纯品，所以用其水解后总单糖的浓度近似计算黑姜多糖的含量。经实验探索，发现以0.2 mg/mL黑姜粗多糖水溶液吸光度在标准曲线范围内，测得的样液0.8 mL时OD625 nm=0.300，带入趋势线方程后得出其单糖浓度为0.087 mg/mL，计算得出黑姜粗多糖中多糖含量为56.07%。

3.3 小鼠体重的变化

小鼠体重的变化见表3和图2。

表3 小鼠体重的变化Table 3 Changes in body weight of mice

图2 小鼠体重灌胃变化Fig.2 Changes in body weight of mice by intragastric administration

由表3可知，小鼠的体重变化在各时间内的显著性均大于0.05，说明小鼠的体重变化在各时间内不存在显著的差异性。图2和表3显示：小鼠体重有回升的趋势，说明小鼠肝脏得到恢复。

3.4 小鼠血糖水平的变化

由表4可知，中高血糖组小鼠在灌胃第0周～第4周血糖值显著下降(P<0.01)。

表4 小鼠血糖水平变化Table 4 Changes in blood glucose levels of mice

4 结论

本实验从新鲜姜发酵后成为的黑姜中提取姜多糖，使用蒽酮硫酸法测定多糖含量，以及测定黑姜多糖对糖尿病小鼠的影响，实验结果发现，黑姜多糖对被四氧嘧啶诱导成的高血糖小鼠有较好的降血糖作用，尤其是对中高血糖的小鼠，血糖值明显降低，回到正常血糖范围，降糖效果显著；对于高血糖值组的小鼠，大部分小鼠血糖值降到7.0～17.0 mmol/L，恢复到中高血糖值，另一部分小鼠血糖值得到良好效果，血糖值降到7.0 mmol/L以下，恢复到正常值；对非糖尿病小鼠的血糖值基本无影响，且对小鼠体重的影响较小。黑姜的研发有着良好的应用前景，有关黑姜多糖的降血糖机理还有待进一步研究，其对糖尿病的治疗值得研发与关注。