董宇晴，崔波，王斌，燕守鑫

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

花椒既是一种香料，又是一种中草药，用途广泛。大量研究表明，花椒籽油具有一定的药理活性，包括温胃、祛寒、除湿、止痛、解毒、止痒等[1-4]。花椒的主要化学成分是挥发油、生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、黄酮、脂肪酸和甾醇。花椒籽是花椒调味料的主要副产物[5-6]，国内外许多研究人员对花椒籽油的脂肪酸组成进行了深入研究。结果表明，花椒籽油由棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸和少量十七碳烯酸组成[7-9]。花椒种子油中油酸、亚油酸和亚麻酸的总含量分别为57.5%、27.9%[10]。Wang等[11]对花椒籽皮油和仁油成分进行了分析，发现花椒籽油中不饱和脂肪酸含量高达90%，高于皮油中的含量，尤其是亚油酸和亚麻酸。文献[12]显示:仁油中的α-亚麻酸含量为35.4%，远高于皮油中的含量，仁油中α-亚麻酸和亚油酸之和高达64.7%。这些发现表明花椒籽油是一种极具开发潜力的油料资源[13]，可调配出脂肪构成合理的天然植物调味油产品[14]。

花椒籽油具有特殊的挥发性风味，主要包括挥发油、生物碱、酰胺类、木质素、香豆素和脂肪酸等[15-16]。特别是，风味物质酰胺类物质是花椒籽油的重要质量指标。花椒酰胺是一类结构相似的链状不饱和脂肪酸酰胺类化合物[17-18]。花椒籽油在贮藏过程中酰胺类物质的变化对花椒籽油的品质有重要影响[19]。花椒酰胺将对人体的各种生理活动产生有益的影响[20]。花椒中的酰胺类化合物包括α-辣椒素、羟基-α-山奈素、羟基-β-辣椒素、γ-辣椒素、羟基-γ-辣椒素、2-羟基-N-异丁基、8-12-十四烷五烯酰胺、2-羟基-N-异丁基-2-(8)-五烯酰胺、2-羟基-N-异丁基-2-(8)-羟基-N[21]。挥发油是花椒籽油中的主要香气物质，主要包括烯烃类化合物和烃类含氧有机化合物[22]。花椒籽油风味物质受品种、产地、温度、光照、当地气候等因素的影响，因此花椒籽油风味物质差异很大[23]。

研究目的：通过对贮藏温度(4 ℃和 20 ℃)、抗氧化剂BHT、TBHQ、PG、迷迭香提取物(RE)、竹子抗氧化剂(AOB)的分析，探讨贮藏温度、抗氧化剂对花椒籽油贮藏品质的影响；采用SPME和GC-MS联用技术，分析了不同处理对花椒籽油贮藏过程中风味物质变化的影响；采用GC分析了不同处理对花椒籽油贮藏过程中脂肪酸组成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒籽油：由淄博淄川鄂庄花椒合作社提供。TBHQ、BHT、PG、RE、AOB、异辛醇和37种脂肪酸标准混合物：购自Sigma公司。分析试剂氯仿、异丙醇、碘化钾、冰醋酸、乙醚、浓盐酸、氢氧化钠、淀粉、硫代硫酸钠、甲醇、三氟化硼甲醇溶液、正己烷和氯化钠：购自天津凯通试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

L350烘箱 上海精宏公司；HPLC1200气相分析仪 美国安捷伦公司；TQ8050 GC-MS分析仪 日本岛津公司；BH-6 -20 ℃冰箱、DB-86 -80 ℃超低温冰箱 青岛海尔股份有限公司；HH-S4水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司；78-1磁力搅拌器 常州智博瑞仪器制造有限公司；5531移液器 Eppendorf艾本德公司；FA2014A分析天平 上海精天电子仪器有限公司；KDM可调控温电热套 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 花椒籽油的储存和取样

根据国家标准规定的油脂中抗氧化剂的种类，选用了3种合成抗氧化剂(TBHQ、BHT和PG)和2种天然抗氧化剂(AOB和RE)，具体添加标准见表1。本实验将所有样品分为A组(4 ℃)和B组(20 ℃)，每组包含10种抗氧化剂组合。油样中加入抗氧化剂的条件为：将0.9 kg花椒籽油放入1.5 L棕色玻璃瓶中，然后加入抗氧化剂，用磁力搅拌器搅拌30 min。最后，在规定的条件下密封存放于棕色玻璃瓶中。在第0，20，40，60，80，100 天至少检测3个样本的POV和AV。样本平均值之间的差异采用邓肯多重比较进行检验。数据之间的相关性分析采用Pearson双尾相关性分析，具体分组见表1。

表1 花椒籽油的储藏方法Table 1 The preservation methods of Chinese prickly ash seed oils

1.3.2 POV的测定

参照GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》。

1.3.3 AV的测定

参考GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》。

1.3.4 脂肪酸的甲酯化反应

甲酯化反应采用三氟化硼甲醇溶剂法[24-26]。将15 mg花椒籽油与5 mL氢氧化钠-甲醇溶液混合，充分摇匀，然后在80 ℃的水浴中加热60 min。在5 mL 15%(W/V)的三氟化硼-甲醇溶液中，混合物在80 ℃的水浴中回流3 min。冷却后加入7 mL正己烷，充分摇匀，然后加入适量饱和氯化钠溶液。最后，上清液用0.22 μm有机膜过滤，然后用GC分析。

1.3.5 GC条件

DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度：260 ℃，进样量：1 μL，无分流，火焰离子化检测器温度：260 ℃，程序升温：起始温度50 ℃，保温1 min，以25 ℃/min升温至100 ℃保温5 min，然后以4 ℃/min升温至240 ℃保温30 min。载气：N2；压力59 kPa；氢气：40 mL/min；空气：400 mL/min。

1.3.6 挥发性风味成分的提取

采用固相微萃取对花椒籽油的挥发性风味成分进行提取[27-28]。将2 mL花椒籽油放入5 mL顶空瓶中，然后加入2 μL异辛醇，混合均匀，用聚四氟乙烯垫片密封。恒温平衡20 min后，固相微萃取针穿过样品瓶垫，将活化后的固相微萃取探针放入水浴中，以70 ℃的温度加热30 min。然后将固相微萃取针快速穿过进样口的硅胶隔离器，突出纤维头，解吸并以250 ℃注入样品。

1.3.7 GC-MS条件

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样温度：50～150 ℃(保持5 min)，升温速率：5 ℃/min，150～280 ℃，升温速率15 ℃/min，10 min，汽化温度：250 ℃，载气：氦气，分流比：50∶1[29-30]。

质谱条件：电离方式：EI，电离电压：70 eV，离子源温度：250 ℃，质量扫描范围：30 mm，400 amu。利用薄层色谱图谱中的峰面积对风味物质进行定量，并以异辛醇为内标得到风味物质的浓度。用NIST文库对风味成分进行定性分析。

1.3.8 统计分析

每项指标至少测量一式三份，数据以平均值±标准差(SD)表示。均数差异经方差分析和邓肯多重极差检验，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 温度对花椒籽油贮藏期间POV和AV的影响

由图1中a可知，随着贮藏时间的延长，POV在4 ℃和20 ℃都呈上升趋势。4 ℃时POV值从2.93 meq/kg增加到25.52 meq/kg，20 ℃时从2.93 meq/kg增加到30.81 meq/kg，这些变化解释了储藏过程中氧气与花椒籽油反应产生过氧化物，导致POV升高[31]。研究表明，低温对花椒籽油的酶活性有抑制作用。而在本实验条件下，花椒籽油在储存期小于40 d时，4 ℃和20 ℃的POV值差异不显著(P>0.05)，花椒籽油的POV值与对照相比差异不显著(P>0.05)。原因可能是食物内部及周围的氧气含量通过抗氧化剂的还原反应降低，一些抗氧化剂如抗坏血酸、异抗坏血酸等容易被氧化，可以使食物中的氧先与其反应，从而避免油脂的氧化[32]。贮藏初期抗氧化剂含量基本相同，且足以与周围环境中的氧结合产生抗氧化作用，贮藏初期效果不显著(P>0.05)。对于较长的储存期(60～100 d)，4 ℃保存的花椒籽油POV值显著低于20 ℃保存的油样(P<0.05)，说明低温保存有利于花椒籽油的保存。

由图1中b可知，AV随储存期的延长呈上升趋势，与储藏温度无关。4 ℃时AV由6.54 mg/g增至31.13 mg/g，20 ℃时由6.54 mg/g增至31.55 mg/g。这是由于随着储存期的延长，水将甘油三酯水解成游离脂肪酸，导致花椒籽油的AV增大。贮藏结束时，20 ℃时的AV明显高于4 ℃时的AV(P<0.05)。

2.2 不同抗氧化剂对花椒籽油贮藏期间POV的影响

由表2可知不同的抗氧化剂对花椒籽油在储存过程中POV的影响。空白组在第0，20，40，60，80，100 天的POV分别为2.93，6.34，12.35，19.84，24.67，30.81 meq/kg，显著高于抗氧化剂处理组(P<0.05)，说明添加抗氧化剂能有效抑制POV的升高[33-34]。不同抗氧化剂处理对花椒籽油贮藏期间POV的影响不同[35]。在抗氧化剂处理中，TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在各个贮藏时间的抗氧化效果(POV值较低)均高于其他抗氧化剂[36-37]。

表2 不同抗氧化剂对花椒籽油贮藏期间POV的影响Table 2 Effects of different antioxidants on POV of Chinese prickly ash seed oils during storage

2.3 不同抗氧化剂对花椒籽油贮藏期间AV的影响

由表3可知，空白组在第0，20，40，60，80，100 天的AV分别为6.54，6.48，11.03，18.23，28.89，31.55 mg/g。通过比较9种抗氧化剂组合在每个贮藏时间的AV，解释了影响AV的主要因素是含水率。测试样品来自同一批次的原材料，因此含水量差异很小[38]。

表3 不同抗氧化剂对花椒籽油贮藏期间AV的影响Table 3 Effects of different antioxidants on AV of Chinese prickly ash seed oils during storage

续 表

2.4 花椒籽油贮藏过程中脂肪酸含量的变化

2.4.1 主要脂肪酸的定性和定量分析

我们选择了3组抗氧化剂(TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG)来分析储存在4 ℃时的脂肪酸。本实验通过36种脂肪酸混合标准的气相色谱分析[39]，得到36种脂肪酸的峰高和36种脂肪酸的浓度，见表4。

表4 36种标准脂肪酸的标准曲线Table 4 The standard curves of 36 standard fatty acids

续 表

2.4.2 抗氧化处理对花椒籽油贮藏过程中脂肪酸含量的影响

由表5～表7可知，在第0，20，40，60，80，100 天时，TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG组合中检测到23种脂肪酸。第0天时，主要脂肪酸为棕榈酸、亚油酸和甲基花生酸，分别占脂肪酸总量的50.13%、35.29%和3.43%。3个组合的棕榈酸含量分别由50.13%降至45.03%、43.1%和41.11%，总体趋势是下降趋势。亚油酸含量由35.29%分别降至30.06%、30.03%和32.01%，总体趋势是下降趋势。甲基花生酸含量由3.43%分别降至1.56%、0.73%和0.59%，总体走势比较平稳。肉豆蔻酸含量由0.78%分别提高到1.94%、1.51%和1.71%，总体趋势是上升趋势。结果表明，添加3种抗氧化剂对主要脂肪酸没有显著影响[40]。据报道，脂肪酸的组成和变化受原产地环境、储存方式和环境的影响。

表5 TBHQ组合花椒籽油在4 ℃储藏过程中脂肪酸组成的变化Table 5 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ during storage at 4 ℃

续 表

表6 TBHQ+BHT组合花椒籽油在4 ℃储藏过程中脂肪酸组成的变化Table 6 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+BHT during storage at 4 ℃

表7 TBHQ+PG组合花椒籽油在4 ℃储藏过程中脂肪酸组成的变化Table 7 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+PG during storage at 4 ℃

续 表

将检测到的脂肪酸分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸。3个组合中饱和脂肪酸主要是甲基硬脂酸，含量分别由1.02%至1.20%、0.88%和4.65%，总体变化态势比较平稳。单不饱和脂肪酸主要为棕榈酸，棕榈酸含量分别由50.13%降至45.03%、43.1%和41.1%，总体趋势是下降的。多不饱和脂肪酸以亚油酸为主，亚油酸含量由35.29%分别降至30.06%、32.03%和32.01%，总体呈下降趋势。综合分析，第0天的饱和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不饱和脂肪酸含量低于第100天，3种抗氧化剂的添加对主要脂肪酸的影响不显著。

2.5 花椒籽油贮藏过程中风味物质的变化

主成分分析(PCA)是一种多元统计方法，它利用降维的思想，在信息损失较少的前提下，将多个指标转化为多个综合指标，它被广泛应用于指标变量的相关性分析[41]。花椒籽油不同储存期的挥发性成分峰面积相对离散，因此采用主成分分析法进行标准化处理，使数据更加简洁，不影响结果。

用GC-MS分析了TBHQ混合物中的挥发性风味物质[42]。以异辛醇为内标对风味物质进行定量分析，利用NIST谱库对风味物质进行定性分析，共检测出19种挥发性风味物质，并对19种风味物质进行主成分分析，见表8。

表8 TBHQ处理花椒籽油储藏过程中挥发性成分的GC-MS测定Table 8 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ during storage determined by GC-MS

由表9可知，第一主成分的方差贡献率为52.493%，第二主成分的方差贡献率为23.697%，第三主成分的方差贡献率为12.267%。一般来说，当主成分的累计贡献率超过85%时，可以用主成分来表示原始数据。因此，这3个主成分基本能反映原始变量的信息。

表9 提取的主成分的特征值和贡献率Table 9 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表10可知，在TBHQ处理的花椒籽油中，第一主成分为β-月桂烯、α-水芹烯、桉树醇、庚酸、环己烯、石竹烯、己酸、2-甲基环己酮、十四烷、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鲨烯，第二主成分为β-水芹烯、花黄素、2-环己烯-1-甲醇，第三主成分为乙酸芳樟酯、豆甾醇。

表10 TBHQ+BHT处理花椒籽油储藏过程中挥发性成分的GC-MS测定Table 10 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+BHT during storage determined by GC-MS

由表11可知，第一主成分的方差贡献率为44.344%，第二主成分的方差贡献率为24.059%，第三主成分的方差贡献率为18.887%。一般来说，当主成分的累计贡献率超过85%时，可以用主成分来表示原始数据。因此，前3个主成分基本能反映原始变量的信息。

表11 提取的主成分的特征值和贡献率Table 11 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表12可知，TBHQ+BHT处理的花椒种子油中，第一主成分是β-月桂烯、α-水芹烯、桉树醇、庚酸、石竹烯、花黄素、2-甲基环己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分是β-水芹烯、乙酸芳樟酯、环己烯、2-环己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。

表12 TBHQ+PG处理花椒籽油贮藏过程中挥发性成分的GC-MS测定Table 12 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+PG during storage determined by GC-MS

续 表

由表13可知，TBHQ+PG处理的花椒籽油中只有一个主成分被提取，因此不能对TBHQ+PG处理的花椒籽油进行主成分分析。

表13 提取的主成分的特征值和贡献率Table 13 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

3 结论

在4 ℃和20 ℃条件下，花椒籽油的POV值随着贮藏时间的延长而增加，抗氧化剂的加入显著降低了花椒籽油的POV值。TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3个组合在4 ℃和20 ℃时的POV均较低，且3个组合的TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在4 ℃时的POV均低于20 ℃时的POV。随着储藏期的延长，AV不断增加，低温对AV的增加有抑制作用。添加抗氧化剂对AV的影响较小。本研究为延长花椒种子油的储存期，提高花椒种子油的品质提供了一定的理论借鉴。

采用脂肪酸GC分析，对贮藏于4 ℃的花椒籽油进行GC分析，通过分析花椒籽油TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3个组成的脂肪酸，发现添加3种抗氧化剂对主要脂肪酸的影响不大。花椒籽油在第0天的饱和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不饱和脂肪酸含量低于第100天，为花椒籽油储藏期脂肪酸的变化提供了一定的理论依据，对花椒油储藏具有一定的指导意义。

采用SPME和GC-MS技术分析了TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG处理4 ℃花椒籽油的风味物质，并用主成分分析法对挥发性物质进行了分析。已知TBHQ处理花椒籽油的第一主成分为β-月桂烯、α-水芹烯、桉树醇、庚酸、环己烯、己酸、2-甲基环己酮、十四烷、石竹烯、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鲨烯，第二主成分为β-水芹烯、花黄素、2-环己烯-1-甲醇，第三主成分为乙酸芳樟酯、豆甾醇。TBHQ+BHT处理花椒籽油的第一主成分主要为β-月桂烯、α-水芹烯、桉树醇、庚酸、花黄素、2-甲基环己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分为β-水芹烯、乙酸芳樟酯、环己烯、2-环己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。