苏现波，汪露飞，赵伟仲，夏大平，周艺璇，王 乾

(1.河南理工大学 非常规天然气研究院，河南 焦作 454003；2.中国地质大学(武汉) 资源学院，湖北 武汉 430074；3.中原经济区煤层(页岩)气协同创新中心，河南 焦作 454003；4.河南理工大学 资源环境学院，河南 焦作 454003；5.河南理工大学 能源科学与工程学院，河南 焦作 454003)

2020 年中国对世界做出了“2030 碳达峰、2060碳中和”的承诺。为实现“双碳”目标，中国将逐步完成以煤炭为主的高碳能源供给体系向清洁、可再生能源为主的低碳能源供给体系的转变[1]。煤炭燃烧供能的同时会排放较多CO2，造成温室效应。至2020 年煤炭在我国能源消费结构中的占比仍高达57%[2]。相较于煤炭(高碳能源)，同属化石能源的天然气则是高效的中低碳能源，在产生相同热值的情况下，其CO2排放量比煤低三分之二左右，表明天然气是高碳能源向低碳洁净能源转化过程中重要的过渡能源，而煤层气正是非常规天然气的重要组成部分。

我国煤层低渗透率、低孔隙率和高地应力的特点[3]，致使煤层气的商业化开发存在困难。A.R.Scott[4]、苏现波[5]等在微生物增产煤层气(Microbially Enhanced CBM,MECBM)概念的基础上进行了升华和创新，提出了煤层气生物工程(Coalbed Gas Bioengineering,CGB)的新技术理念。这一技术是将经过选育、驯化、改良的菌种注入地下煤层或采用地面发酵产气的方式，通过厌氧发酵把煤的部分有机组分转化为甲烷，实现煤层气增产和碳减排的双重目标。近年来，关于煤层气生物工程的研究主要集中在煤厌氧发酵制取生物甲烷的生成途径、强化生物甲烷产出和微生物对煤储层的改性等方面。目前，普遍认为煤制生物甲烷需要经过水解、酸化、产氢产乙酸和产甲烷4 个阶段，煤中复杂聚合物的分子量过大，不能被产甲烷菌直接利用，需要先被会水解发酵菌释放的胞外酶分解成小分子聚合物，而后这些小分子聚合物被一些产酸菌利用，生成氨、氢气和挥发性脂肪酸等，再次在产氢产乙酸菌的作用下挥发性脂肪酸被进一步降解，形成了产甲烷菌可直接代谢底物：二氧化碳、氢气和乙酸，最后产甲烷菌利用底物生成生物甲烷[6-7]。强化生物甲烷产出的方式主要有生物刺激、生物强化和提高煤的生物利用度等。实验证明外加电场驯化能够促进厌氧发酵系统中细菌与产甲烷古菌的协同合作，进而提高生物甲烷的产量[8-9]。美国Luca 公司在粉河盆地进行了先导性试验，试验井在添加培养基后，每口井的产气量比预期增加了1 260 m3，恢复到历史峰值产气量的50%左右[10]。通过引进外源菌种来改善本源菌种的产甲烷能力可显著提高生物甲烷的生成。有研究表明，产甲烷菌与牛瘤胃消化液中富集得到的厌氧真菌混合，能够快速降解大麦秸秆同时产生甲烷[11]。使用物理、化学和生物的手段对煤样预处理，同样可以提高煤的生物利用度，进而强化生物甲烷的产出[12]。将煤进行研磨，可以增加微生物与煤的附着面积；利用高锰酸钾、过氧化氢等强氧化剂溶解煤，可以实现煤的解聚；使用白腐菌、芽孢杆菌等强降解能力的菌对煤进行降解，可以破坏煤结构，提高甲烷的生成效率。另外，超临界CO2萃取(Sc-CO2)-厌氧发酵联作增产煤层气逐渐被重视，在理想条件下，煤储层埋藏深度超过800 m 时，煤储层温度和压力容易使CO2达到超临界状态(温度大于31.06℃，压力大于7.39 MPa)[13]。Sc-CO2与煤有机基团作用可改变煤的理化性质。Sc-CO2的扩散系数为液态CO2的100 倍，具有良好的扩散性[14]。Sc-CO2能够有效萃取复杂化合物中的有机物，煤中非共价键的破坏导致小分子有机物从煤的大分子结构中脱落[15]，易被微生物利用生成甲烷。有学者利用压汞仪和孔渗仪对生物作用后的残煤进行测试，发现生物转化能够增大煤表面的粗糙程度，增加煤的孔隙和渗透率，孔隙的连通性增强，有利于甲烷的解吸[16]。在常规厌氧发酵中CGB 的可行性与优越性已得到了证实，而在煤储层原位条件下，微生物厌氧降解煤制取生物甲烷的研究还存在空白。前期国内外开展的先导性试验一般都是在煤层中添加营养液来刺激煤层中本源微生物生产甲烷[17-18]，而真正结合CGB 的核心理念，将经过驯化后的高效产甲烷菌群注入地下煤层的探索还未见报道。

笔者为了解CGB 在原位储层条件下的产气潜力，通过自主设计的原位厌氧发酵实验装置物理模拟煤储层原位温压条件和气体组分，将驯化后的本源菌群注入厌氧发酵罐，进行厌氧发酵制取生物甲烷，对比厌氧发酵前后气、固、菌的差异性，证实储层原位条件下生物甲烷生成的可行性，计算在Sc-CO2参与下生物气组分的产量，并揭示不同发酵系统生物甲烷化过程中微生物的差异性。

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

1.1.1 实验材料

煤样取自新疆地区某煤层气区块目标煤层的新鲜煤样，编号为XJ，煤质分析见表1。煤样真空干燥12 h后，研磨并筛分至80～100 目(180～150 μm)。实验菌源从原位煤样中富集得到。产甲烷菌的液体培养基(g/L)：NH4Cl 1.0，MgCl2·6H2O 0.1，K2HPO4·3H2O 0.4，KH2PO40.2，酵母膏 1.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，Na2S 0.2，NaHCO32.0，乙酸钠 2.0，胰蛋白胨 0.1，微量元素液10.0 mL。微量元素液(g/L)：氨基三乙酸 1.5，MgSO4·7H2O 3.0，CoCl2·6H2O 0.1，MnSO4·2H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，NaCl 1.0，FeSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.01，KAl(SO4)20.01，H3BO30.01，Na2MoO40.01。

表1 煤样的基本性质参数Table 1 Property parameters of coal samples

1.1.2 实验设备

500 mL 厌氧发酵罐4 个、压力表4 个、四通阀4 个、小型液压式计量泵、气体增压泵、抽真空泵、恒温培养箱、气体流量计、液体流量计、干燥管(图1)。

图1 原位厌氧发酵装置Fig.1 In-situ anaerobic fermentation device

1.2 实验方法

1) 本研究选取新疆地区某煤层气区块目标煤储层为研究对象，物理模拟目标煤储层的原位储层条件，储层压力(8.6 MPa)、温度(35℃) 和原始气体组分(CH475%，CO225%)。从煤层中提取本源菌群，经过实验室长期驯化后，得到高效的产甲烷菌群。

2) 以4 个500 mL 的厌氧发酵罐为反应容器，分别编号1、2、3、4，每个罐加入50 g 煤样(80～100 目)作为降解底物，其中1 号为常规厌氧发酵系统，2、3、4号为原位厌氧发酵系统。根据理想气体状态方程计算出每个发酵罐的自由体积后，将发酵罐抽至真空。通过气体流量计向2、3、4 号发酵罐中注入CH4至发酵罐压力达到4.0 MPa，然后再向2、3、4 号发酵罐内注入CO2至发酵罐压力达到4.8 MPa。利用小型液压式计量泵将生物发酵液泵入3、4 号发酵罐至发酵罐压力达到煤层原位压力(8.6 MPa)，将无菌水泵入到2 号样品罐至相同储层压力，最后向1 号发酵罐加入同体积的生物发酵液。将4 个发酵罐同时放在35℃的恒温培养箱中，等待罐内气体吸附稳定后，收集2、3、4 号厌氧发酵罐内的原始气体组分10 mL，做初始阶段的气体组分测试。参照文献[19]，常规厌氧发酵的发酵时间设置为30 d，当3 号发酵罐内气体浓度不再变化时(60 d)，视为原位厌氧发酵结束，通过干燥管和气体流量计缓慢解吸厌氧发酵罐中的气体，记录混合气体的体积和气体组分。

3) 本研究中1 号发酵罐为常规厌氧发酵罐，用来对比常规厌氧发酵系统与Sc-CO2参与下原位厌氧发酵系统中的气相产物、固相产物和微生物群落结构的差异性。2 号发酵罐作为空白对照罐，通过参照空白对照罐注入前后气体体积差来折算3 号发酵罐和4 号发酵罐内溶解、吸附的气体体积，从而推算出储层原位条件下的实际产气量。3 号发酵罐为取气测试罐，每隔5 天进行取气检测，用来记录原位储层条件下不同发酵阶段气体组分随时间的变化规律。4 号发酵罐作为3 号发酵罐的平行样，用来验证原位产气数据的可靠性。

1.3 分析测试方法

1.3.1 微生物多样性分析

对原始菌液和厌氧发酵后的菌液平行取样3 次，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA 的纯度和浓度检测，检测合格后进行16SrRNA 测序。

1.3.2 气相产物检测

利用气相色谱检测仪(GC-4000A)对常规厌氧发酵系统和原位厌氧发酵系统的气相产物进行组分测试分析，检测器为热导(TCD)，10 阶程序升温，升温速率0.1～40℃/min，TDX-01 色谱柱，载气为氦气。

1.3.3 红外光谱分析

采用红外光谱仪(HYPERION2000)对发酵前后的煤样进行测试，光谱范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.4 相关计算

式中：c为二氧化碳的生物转化率；vt为原位厌氧发酵结束后3 号厌氧发酵罐内二氧化碳由于溶解、吸附和微生物转化而减少的量，mL；vd为不参与生物发酵的2 号空白对照罐内二氧化碳由于溶解和吸附而减少的量，mL；v为3 号厌氧发酵罐内二氧化碳的注入量，mL。

2 结果与讨论

2.1 产气分析

常规厌氧发酵系统与Sc-CO2参与的原位厌氧发酵系统中生物甲烷生成量分别为4.35 mL/g(图2a)和32.9 mL/g(图2d)，后者是前者的7.56 倍。常规厌氧发酵系统的产甲烷高峰期出现在第20 天，随后甲烷产量开始大幅下降并逐渐停止，这与前人在实验室研究的低变质煤厌氧发酵产气结果基本相符[20]。原位厌氧发酵开始的第0～10 天 CO2浓度大幅降低，CH4浓度升高，有少量的N2和H2，说明该阶段主要以CO2吸附和溶解为主，同时N2、H2的生成，说明CO2生物甲烷化开始。H2浓度在第5 天达到峰值，随后开始降低，说明原位条件下的生物甲烷在第5 天开始生成，CH4浓度在第5～10 天的激增应是CO2溶解和生物甲烷化的叠加影响造成的。第10～60 天原位厌氧发酵罐内的CO2浓度停止大幅下降，说明厌氧发酵罐内CO2达到了溶解平衡，此时CO2浓度降低是由于微生物的利用，合成了生物甲烷。原位厌氧发酵系统经过60 d 后，对发酵罐内的气体进行解吸和对比发现，CH4体积增加了7.65%，CO2体积减少了30.23%，而注入无菌水的厌氧发酵罐2，微生物不参与发酵，气体只有溶解和吸附损失，CH4和CO2的体积分别减少了0.01%和13.50%。该Sc-CO2储层原位条件下，厌氧发酵罐2 内CO2的减少量(829 mL)近似为厌氧发酵罐3 内CO2溶解和吸附的量vd，厌氧发酵罐3 内CO2的减少量(1 952 mL)为CO2溶解、吸附以及微生物转化利用的总量vt，厌氧发酵罐3 内二氧化碳的注入量v由图可知为6 458 mL，由1.3.4 的相关计算公式得出Sc-CO2储层原位条件下，CO2的生物转化率为17.4%(图2b-图2d)。

图2 常规厌氧发酵与原位厌氧发酵的产气数据Fig.2 Gas production data of conventional anaerobic fermentation and in-situ anaerobic fermentation

2.2 煤的官能团分析

2.2.1 测试结果

厌氧发酵前后煤中官能团的变化如图3 所示，红外光谱划分为羟基吸收带(波数3 600～3 100 cm-1)、脂肪结构吸收带(波数3 000～2 800 cm-1)、含氧官能团吸收带(波数1 800～1 000 cm-1)和芳香结构吸收带(波数900～700 cm-1)4 个部分[21]，并在图谱上标出13 个不同强度的吸收峰变化。

图3 FTIR 吸光度图谱Fig.3 FTIR absorbance spectrum

2.2.2 官能团定性分析

根据FTIR 对吸收峰归属的划分[22]，1 号、2 号吸收峰位于羟基吸收带，属于煤中醇、酚羟基的伸缩振动，在原位条件下厌氧发酵罐内的Sc-CO2对煤样进行萃取，煤样中的羟基被萃取脱落，特征吸收峰消失[15]。3 号、4 号吸收峰位于脂肪结构吸收带，属于甲基和亚甲基的伸缩振动，煤样经过微生物厌氧发酵后，甲基和亚甲基峰的吸收峰强度降低，说明微生物可能利用甲基和亚甲基合成了甲烷。5、6、7、8、9 号吸收峰位于含氧官能团吸收带，该区域主要是羧基、羰基和醚氧的伸缩振动，同时还包含了芳环上碳碳双键的振动、脂肪链上CH2和CH3的弯曲振动等。10、11、12、13 号吸收峰位于芳香结构吸收带，是煤芳香结构CH面外变形振动的区域，FTIR 光谱表明，Sc-CO2萃取-微生物厌氧发酵联作系统对苯酚、醇、醚、酯中含氧基团的降解能力要强于常规的厌氧发酵系统。

2.3 群落结构差异性分析

2.3.1 细菌群落变化

分析了同一时间点不同厌氧发酵系统内微生物群落的组成结构(图4)。基于16S rRNA 测序结果，原始菌液中微生物群落优势细菌门类是厚壁菌门(Firmicutes)、互养菌门(Synergistota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria)，约占初始阶段总相对丰度的97%。经过30 d 的常规厌氧发酵后，厚壁菌门和变形菌门分别从37.35%和25.54%下降到14.99%和3.77%，而互养菌门和脱硫菌门(Desulfobacterota)分别从13.29% 和0.25% 增加到33.69% 和12.52%。优势菌属由Pseudomonas(25.49%降到1.47%)和Para-clostridium(10.47%降到0.17%)变成了Syner-01(3.25%增到15.21%)、Sphaerochaeta(1.16% 增到11.87%)和Syntrophobacter(0.21%增到10.82%)。Pseudomonas和Paraclostridium拥有极强的降解能力，能够降解结构复杂的长链烷烃，同时也能参与碳水化合物的发酵[23-24]，在厌氧发酵后期底物的不足导致其生长繁殖受阻。Syner-01 是Synergistaceae家族的成员，该家族是合成型乙酰和氨基酸氧化细菌[25]，Syner-01 和Sphaerochaeta都能代谢氨基酸产生乙醇、乙酸、乳酸、H2和CO2，作用于厌氧发酵后期的产氢产乙酸阶段，丰度较高。在经过60 d 的原位储层条件的厌氧发酵后，森林土源芽孢杆菌Solibacillus(0.008%增到60.24%)成为了菌群中唯一的优势菌种，这种菌不利用葡萄糖及相关糖类作为碳源，却对乙酸和丙酮酸有着显著的利用，这表明Solibacillus silvestris产生能量的途径不同于利用葡萄糖代谢途径[26]。

2.3.2 古菌群落变化

不同于细菌群落，古菌群落的结构相对简单，检测出的古菌菌属只有Methanosarcina、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanosaeta(图4b)。常规厌氧发酵系统以甲烷八叠球菌属Methanosarcina(67.15%)和甲烷囊菌属Methanoculleus(23.09%) 为主，Methanosarcina是已知的唯一能够利用所有产甲烷途径(乙酸营养途径、氢营养途径和甲基营养途径)的产甲烷微生物菌属，常被视为乙酸营养型的代表。而Methanoculleus只能利用H2将CO2还原成CH4，属于氢营养途径的产甲烷微生物菌属，可见常规厌氧发酵系统是多种途径同时进行合成甲烷。在原位厌氧发酵系统中，Methanoculleus以绝对的数量优势，成为环境中的优势菌属。在常规厌氧发酵中占据优势地位的Methanosarcina，只占原位厌氧发酵系统古菌总相对丰度1.15%，氢营养途径的产甲烷微生物菌属Methanoculleus和Methanosaeta占到了原位厌氧发酵系统总相对丰度的96.44%，说明原位厌氧发酵系统是以氢营养为主要途径来合成甲烷。Methanosaeta的丰度下降，可能是受到了Solibacillus silvestris的影响，Solibacillus silvestris在环境中有较强的竞争能力和适应能力，利用了环境中产生的乙酸，导致Methanosaeta缺乏代谢底物而丰度降低，乙酸裂解产生甲烷的途径被抑制。

图4 细菌群落和古菌群落的相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities and archaeal communities

3 结 论

a.Sc-CO2参与下储层原位厌氧发酵产生的生物甲烷是常规厌氧发酵的7.56 倍。在该储层条件下，CO2的吨煤减少量为39.0 m3，其中16.6 m3的CO2被溶解，22.4 m3的CO2被微生物转化，说明煤层气生物工程能够为煤层气增产和“双碳”目标的实现提供有效途径。

b.常规厌氧发酵系统和原位厌氧发酵系统对煤进行生物发酵产气后，煤中的甲基、亚甲基均脱落，苯酚、醇、醚、酯中含氧基团被不同程度地降解。储层原位条件下微生物对煤的降解更为彻底。

c.Sc-CO2参与的储层原位条件下，产甲烷菌群由原始群落中参与多种产甲烷代谢途径的产甲烷菌逐渐向单一的氢营养型产甲烷菌演化。森林土源芽孢杆菌Solibacillus silvestris成为细菌菌群中的优势菌属，目前正在针对该菌属的代谢特征和耐压机制开展深入研究。