韩佳瑞，庞欣欣，郑 威，商海涛，彭紫凝，王 琳

(1.河南中医药大学第二临床医学院，郑州450046； 2.河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院肾病科，郑州 450002； 3.郑州颐和医院全科医学科，郑州 450047)

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)为常见的自身免疫性疾病，也是导致肾衰竭的常见原因之一[1]。MN的病理损伤以肾小球毛细血管壁均匀一致增厚为特征，弥漫性免疫复合物在肾小球上皮下堆积，并伴有新的基底膜合成[2]。目前，尚无有效治疗MN的药物和方法，临床治疗以糖皮质激素、免疫抑制剂，以及减少尿蛋白、降压和抗凝等药物控制和缓解病情为主，以保护肾功能和减少并发症[3]。然而，MN的临床治疗仍有较大问题，免疫抑制剂的种类、疗程和剂量的不同会影响疗效并增加感染风险，甚至诱发肿瘤，存在易复发、无应答率高等不良事件，仍要尝试探寻新的治疗方法和手段[4-5]。近年来，随着中医药的临床发展，中医药治疗MN受到更多重视。昆明山海棠为雷公藤属植物，以根茎入药，其临床制剂多用于自身免疫性疾病[6]。研究结果表明，昆明山海棠可以抑制肾脏免疫反应，降低肾小球滤过膜的通透性，减少微血栓形成，降低蛋白尿水平，改善肾功能[7]。Meta分析结果显示，以昆明山海棠为主要原材料的中成药昆仙胶囊配合常规疗法可提高肾病综合征的临床疗效，且不良事件较少，安全性佳[8]。研究结果显示，昆仙胶囊治疗肾病综合征疗效确切，不良反应少[9-10]。但其潜在的机制尚不明确。本研究利用网络药理学，挖掘分析昆明山海棠的有效成分，引入其作用于MN的靶点，进行“疾病-药物-分子-靶点”交互作用可视化分析，以及基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，为昆明山海棠多成分、多靶点、多通路治疗MN的作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 筛选昆明山海棠的有效成分及靶点

BATMAN-TCM在线分析工具库来源于Drug Bank、治疗靶点数据库(TTD)、KEGG和人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)等多个线上数据库，能够分析预测中药潜在靶标[11-12]。本研究采用BATMAN-TCM检索昆明山海棠的有效成分和相关靶点。参数设置：分数(Score cutoff)最低为系统推荐分数20，调整后P值(AdjustedP-value)临界值为0.05，以此来筛选昆明山海棠的有效成分即化合物，以及最佳匹配靶点。

1.2 检索MN的相关靶点

公共数据库GeneCards是基因信息最全面的公开性生物信息数据库，包含了以人类基因为中心的约150个网络来源的基因注释和预测[13]；以“Membranous nephropathy”为关键词在GeneCards里筛选与MN有关的所有靶点，并在DisGeNET、TTD、DrugBank和GAD等数据库中筛选补充。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

PPI关系是中医药使用网络药理学技术挖掘出关键靶点的重要途径[14]。应用STRING数据库，构建并选出核心靶点，构建PPI网络[15]。筛选参数设置主要有：选择人类为生物机体，最低要求交互分数设置最高置信度0.4。

1.4 昆明山海棠治疗MN网络调控可视化

基于昆明山海棠和MN的PPI靶点数据，引入昆明山海棠可作用于MN的有效成分，取二者交集的数据，采用软件Cytoscape 3.7.2 将其制作成可视化网络图，即得到昆明山海棠治疗MN的“疾病-药物-分子-靶点”调控网络图。

1.5 GO和KEGG富集分析

DAVID数据库能够挖掘基因和疾病之间的相关性，其中GO功能富集分析包含不同细胞、分子和生物功能。采用GO功能富集分析，并对昆明山海棠和MN交集蛋白靶标基因进行KEGG通路富集分析，得出昆明山海棠治疗MN的相关作用通路。调整后P值在图中按照显著性排序。

2 结果

2.1 昆明山海棠的有效成分及靶点分析

按照分数>20，调整后P值<0.05为筛选条件，检索BATMAN-TCM数据库中昆明山海棠的成分与靶点，得到昆明山海棠有效成分15个，有效靶点123，剔重后得到靶点78，其中预测靶点即基因名称排序按得分下降排序，见表1。

2.2 昆明山海棠作用靶点和MN相关靶点检索结果

在GeneCards、DisGeNET和TTD等数据库中筛选MN与该疾病相关的靶点，去除重复靶点，得到与MN疾病相关的靶点3 191个。纳入昆明山海棠的78个预测靶点，取药物(昆明山海棠)和疾病(MN)交集，得到35个共同靶点，见图1。

图1 昆明山海棠有效靶点与MN相关靶点

2.3 “昆明山海棠-MN”作用靶点的PPI关系分析

对“昆明山海棠-MN”的35个相互作用靶点进行分析，通过STRING数据库分析得到51条PPI关系，导入Cytoscape软件，度值越大则圆形越大，两个靶点之间连线的越粗表示PPI关系越强，见图2。取其中富集节点数目最多的前30个靶点，做出柱状图，得到前30个“昆明山海棠-MN”核心靶点，横轴显示富集节点数目，纵轴显示靶点基因名称，见图3。

图2 昆明山海棠与MN的PPI关系图

图3 昆明山海棠治疗MN的核心作用靶点

2.4 昆明山海棠治疗MN网络可视化分析

通过Cytoscape软件，纳入PPI网络筛选的“昆明山海棠-MN”的35个相互作用靶点和分析筛选得到15个昆明山海棠可用有效成分，进行昆明山海棠治疗MN的网络的“疾病-药物-分子-靶点”互相作用的可视化分析，同时在网络中加入疾病和药物使网络图更加直观。网络可视化图见图4；图中，六边形代表昆明山海棠，菱形代表MN，三角形代表昆明山海棠15个有效作用成分，圆形代表昆明山海棠作用于MN的35个靶点。

图4 “昆明山海棠-MN-有效成分-靶点”网络关系图

2.5 昆明山海棠治疗MN的机制分析

通过DAVID 工具对昆明山海棠和MN交集蛋白靶标基因进行GO功能富集分析，得到昆明山海棠干预MN治疗的作用靶点的生物学功能42种，综合分析后取前20种功能特性，得到昆明山海棠有效成分靶点主要通过这些生物学功能特性治疗MN，如类固醇结合性、核受体活性和直接配体调控特异性DNA序列结合性等，见图5。利用DAVID工具分析KEGG信号通路，发现昆明山海棠治疗MN的信号通路共41条，以富集靶点多少排序取前20条分析结果，见表2。所有结果均符合调整后P值<0.05。

表2 昆明山海棠治疗MN的关键信号通路

“count”值气泡代表与该生物学功能相关的靶点数量，气泡越大，靶点越多，调整后P值<0.05

表 1 昆明山海棠的有效成分与靶点

3 讨论

MN是导致成年人肾病综合征最常见的原因，可归属于中医“水肿”“尿浊”和“腰痛”等范畴。MN早期多见风湿相搏，脾失健运，脾虚不能升清，谷气下泄表现为蛋白尿，水湿浸淫以致水肿；中期以湿浊为主，阴阳失和，气滞血阻，秽浊积蓄；日久瘀浊蕴壅或因虚致瘀，终致肾脏衰败[16]。中药学认为，昆明山海棠有祛风除湿、活血解毒等功效，符合MN的中医病机。研究结果表明，昆明山海棠有保护肾脏的功能，通过减轻系膜细胞增生，减少微血栓形成，改善肾小球滤过，减少蛋白滤出，延缓肾病进展[17]。临床上，昆仙胶囊也被广泛用于MN的治疗中，取得了显著的疗效，但目前对昆明山海棠治疗MN的机制还不完全清楚。

本研究通过网络药理学方法，得到昆明山海棠治疗MN的有效成分有15种，其中雷公藤甲素(Triptolide)和雷公藤内酯酮(Triptonide)不仅可以抗炎、抗氧化，还具有免疫抑制作用；雷公藤乙素(Tripdiolide)可以改善微循环，在纠正肾脏糖代谢、调节细胞因子方面有优势[18]；原花青素C和原花青素B4均可以清除自由基，具有抗氧化、抗炎的作用[19]。根据“昆明山海棠-MN”的PPI关系分析，昆明山海棠治疗MN的核心作用靶点主要有雄激素受体(AR)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和糖皮质激素受体基因(NR3CI)等。有研究结果认为，AR影响细胞免疫，有抗炎作用，可能与MN有关[20]；mTOR影响促炎因子的产生，与MN密不可分[21]；FGF2可调节活性氧，减轻氧化损伤，影响肾小球硬化过程[22]。通过GO功能富集分析，得到昆明山海棠核心作用靶点主要通过类固醇结合性、核受体活性、转录因子活性和激素结合等生物学特性治疗MN。

本研究通过DAVID工具进一步对关键靶点进行KEGG信号通路分析，得到昆明山海棠主要通过mTOR信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、甲状腺激素信号通路和癌症多糖蛋白信号通路等治疗MN。其中mTOR信号通路为关键通路，参与了肾脏炎症反应和纤维化发生发展[23]。mTOR激酶包括mTORC1和mTORC2，mTORC1过度激活会促进血管内皮生长因子、单核细胞趋化蛋白1和血小板源性生长因子等促炎因子的生成，增加肾小管间质炎症，从而推进MN病情进展[24]。磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)刺激Akt发生磷酸化，激活mTORC1，促进辅助性T淋巴细胞(Th1、Th17)发生细胞免疫反应，维持促炎因子的活性，诱发机体发生免疫炎症[21]。有研究结果表明，抑制mTORC1过度激活可以有效调节免疫，阻断炎症，从而延缓肾间质纤维化，防止MN病情恶化[25]。PI3K-Akt信号通路是昆明山海棠治疗MN的一个重要通路。PI3K-Akt信号通路主要参与细胞生长、代谢和凋亡过程，并与炎症细胞因子的激活释放有关[26]。PI3K作为关键的物质被激活后催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成PIP3，通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)途径使Akt磷酸化，引起PI3K-Akt信号通路反应，激活调控肾脏细胞自噬，抑制足细胞凋亡，改善肾上皮间充质转化，从而缓解肾脏纤维化[27-28]。

综上所述，昆明山海棠治疗MN主要涉及类固醇结合性等多重生物学特性，干预mTOR信号通路等多条信号通路。网络药理学和生物信息学分析作为一种新兴技术，不仅为探索昆明山海棠治疗MN的作用机制研究提供了理论支撑，还为进一步设计临床和实验研究等提供相对系统的理论依据，促进了昆明山海棠治疗新方向的形成。