周怡驰　晏军　李玲　冉云　胡世平　党志博　苏晓鹏

摘要目的：從肝气虚证角度并通过网络药理学探讨黄芪柴胡干预肝炎的作用机制。方法：检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）等数据库，筛选黄芪柴胡干预肝炎的活性成分和作用靶点。构建化合物靶点疾病网络和蛋白质蛋白质相互作用（PPI） 网络，进行拓扑学分析，筛选关键药效分子和核心靶点。对作用靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，并用Cytoscape软件构建化合物靶点通路网络。结果：黄芪柴胡通过升补肝气治疗肝炎患者肝气虚证。经网络药理学分析，筛选出黄芪柴胡14个关键药效分子，19个核心作用靶点与其干预肝炎密切相关。分子对接结果显示，度值前10的核心靶点能与黄芪柴胡的关键活性成分形成较稳定的构象，具有良好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症、氧化应激、细胞增殖等生物学过程。结论：黄芪柴胡或通过槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分作用于Toll样受体、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、PI3K/AKT、MAPK、IL17等信号通路，参与调节氧化应激反应、肝脏炎症反应、细胞增殖等生物学过程，发挥干预肝炎的作用。

关键词黄芪;柴胡;肝气虚证;肝炎;网络药理;分子对接;槲皮素;氧化应激

Mechanisms of Astragalusradix Bupleuri in Intervening Hepatitis Based

on Liver Qi Deficiency Syndrome and Network Pharmacology

ZHOU Yichi，YAN Jun，LI Ling，RAN Yun，HU Shiping，DANG Zhibo，SU Xiaopeng

（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100020，China; 2 Shenzhen

Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Shenzhen 518172，China）

AbstractObjective：Investigating the theoretical foundation of AstragalusRadix bupleuri in treating patients with hepatitis from liver qi deficiency syndrome and exploring the possible mechanisms of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis by using the method of network pharmacology.Methods：Effective components and targets of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis were obtained from TCMSP and other databases.Then，“componenttargetdisease” network and proteinprotein interaction（PPI） network were established in Cytoscape and STRING database respectively，to ascertain the key efficacy components and targets.Molecular docking simulations were evaluated through Autodock vina software.Finally，GO and KEGG enrichment analysis were performed，and “compoundtargetsignaling pathway” network was also established in Cytoscape.Results：AstragalusRadix bupleuri can treat patients with hepatitis of liver qi deficiency by lifting and tonifying liver qi.The fourteen core active components and nineteen key targets of AstragalusRadix bupleuri were closely related to the intervention of hepatitis.Molecular docking results indicated that the top 10 key targets of degree values can form stable conformations with key compounds of RB and had favorable binding activities.Go and KEGG analysis revealed that the targets of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis significantly enriched in biological processes such as inflammation，oxidative stress，cell proliferation and TLR signaling pathway.Conclusion：AstragalusRadix bupleuri acts on Tolllike receptors，Th17 cell differentiation，Th1 and Th2 cell differentiation，PI3K/AKT，MAPK，IL17 and other signaling pathways through active components such as quercetin，kaempferol，and formononetin.It participates in the regulation of oxidative stress response，liver inflammatory response，cell proliferation and other biological processes，and plays a role in intervening hepatitis.

KeywordsAstragalus; Radix bupleuri; Syndrome of liver qi deficiency; Hepatitis; Network pharmacology; Molecular docking; Quercetin; Oxidative stress

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.001

流行病学资料显示，肝炎发病率较高，提高肝炎的治愈率和防治慢性肝炎、肝硬化和肝癌的发展是医学研究的重要方向。在肝炎的治疗中，中医药具有较大的优势和前景。黄芪和柴胡广泛运用于肝炎的治疗中。黄芪和柴胡配伍不仅能补益中气、疏肝解郁，还能升补肝气，治疗肝炎肝气虚证，但有关研究较少，故本研究拟从肝气虚证角度探讨黄芪柴胡治疗肝炎的理论依据，并运用网络药理学，分析和预测黄芪柴胡干预肝炎的作用机制，为药物开发和临床拓展应用提供参考。

肝气虚是指肝脏的精气虚损及功能活动的减退[1]，早在《黄帝内经》就有相关描述，如《素问·上古天真论》云：“七八，肝气衰，筋不能动。”《诸病源候论》中论述较为详细：“肝气不足，则病目不明，两胁拘急筋挛，不得太息，爪甲枯，面青，善悲怒，如人将捕之。”后世历代医家对肝气虚证的论述甚少，究其原因与肝脏的特性密切相关。肝藏血，主疏泄，肝为刚脏，体阴而用阳，其性主升主动，故常见肝阴肝血不足，肝气肝阳有余。但在当今临床肝炎患者中，肝气虚证的临床表现颇为常见，尤其是疲乏或不耐劳累，正如医家张伯臾认为：“临床中肝气虚、肝阳虚并不少见，在肝炎肝硬化病例中尤多。”肝气虚证离不开肝的疏泄、藏血、调畅情志功能失常及外窍失养，因此除了表现为不耐疲劳，还可见肝经所过部位如胁肋隐隐作痛，肝的疏泄不及影响到脾的升清，导致便溏，以及肝气不舒，情志默默等。

肝炎肝气虚证的治疗重视补益肝气，同时注重疏肝，既补肝体，又调肝用。张锡纯认为，肝主气化，人之元气自肾达肝，由肝升发元气于全身，故有肝为“人身元气萌芽之脏”“气化升发之始”之谓。治疗上推崇重用黄芪升补肝气，其认为“黄芪之性温而上升，以之补肝，原有同气相求之妙用。愚自临证以来，凡遇肝气虚不能条达，用一切补肝之药皆不效，重用黄芪为主，而少佐以理气之品，服之覆杯即见效验。”近代中医学者也肯定了黄芪补肝气的疗效[2]。黄芪补肝的同时，补益脾胃之气。脾胃为后天之本，气血生化之源，通过脾土荣木，助肝之气血化生。黄芪还具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水退肿等功效。黄芪的有效成分具有抗炎、改善微循环及肝脏的合成功能、调节免疫，抑制肝炎病毒复制等作用[3]。柴胡能和解表里、疏肝升阳、疏散退热，其成分柴胡皂素有抗炎、抗过敏、镇静、镇吐等作用，能改善肝功能，抑制乙肝病毒[4]。黄芪配伍柴胡行气理肝，既补肝体，又能通过顺肝疏泄之性，以助生肝气。

1资料与方法

1.1黄芪柴胡的活性成分及靶点的筛选基于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别检索柴胡、黄芪的化学成分，设置阈值口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥018为限定条件[5]，筛选活性成分，在TCMSP中收集活性成分对应的靶点，利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）校正靶点的官方名称并筛除非人类靶点蛋白。

1.2肝炎相关基因的收集利用OMIM数据库（http：//www.omim.org/）、TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）检索关键词“Hepatitis”獲取肝炎相关基因，将3个数据库的结果进行合并，筛选并删除重复靶点，得到肝炎相关基因。

1.3化合物靶点疾病网络的构建与分析使用Venny 210工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图，获得柴胡、黄芪干预肝炎的潜在作用靶点。利用Cytoscape 372软件（https：//cytoscape.org/）构建化合物靶点疾病网络，利用“Network Analyzer”软件对网络进行拓扑学分析，将点度中心性≥2倍中位数、中介中心性和接近中心性≥1倍中位数的靶点作为本研究得到的关键药效分子[6]。

1.4蛋白质蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析将潜在靶点导入STRING数据库（https：//stringdb.org/），设置物种为人，获得潜在靶点的PPI网络。利用“Network Analyzer”软件对网络进行拓扑学分析，计算节点的度值、中介中心性和接近中心性，将满足度值≥2倍中位数、中介中心性和接近中心性≥1倍中位数的靶点作为核心靶点。

1.5分子对接验证从Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载度度值前10的关键药效分子成分的结构文件，从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）上下载度值前10的核心靶点蛋白的结构文件，使用PyMol软件对受体和配体分子进行去水、加氢处理，利用Autodock_vina软件进行分子对接，计算活性成分与靶点蛋白的最低结合能，并利用PyMol软件对对接结果进行可视化。一般认为，配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，根据文献报道，结合能≤-50 kcal/mol（1 cal=4184 J）提示关键药效分子和核心靶点具有良好的结合活性[7]。

1.6富集分析及化合物靶点通路网络的构建基于R语言软件ClusterProfiler（Version 3120）对作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，设定阈值P<005，用R软件对前20的结果进行可视化，在Cytoscape 372软件中针对显著性前20的通路构建化合物靶点通路网络。

2结果

2.1黄芪柴胡活性成分及其作用靶点、肝炎的靶点在TCMSP数据库中共检索到黄芪柴胡活性成分28种及120个作用靶点。见表1。从OMIM、TTD，以及DisGeNET数据库共获得肝炎相关基因846个。筛选出41个黄芪柴胡干预肝纤维化的作用靶点。见图1。

2.2化合物靶点疾病网络黄芪柴胡干预肝图1黄芪柴胡和肝炎靶点韦恩图

炎的化合物靶点疾病网络。见图2。网络共有70个节点和272条边，其中蓝色节点代表靶点，紫色靶点代表黄芪的活性成分，红色代表柴胡的活性成分，黄色代表黄芪与柴胡共有的活性成分。对网络进行拓扑学分析后发现，槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、刺芒柄花素（MOL000392）、美迪紫檀素（MOL000371）、异鼠李素（MOL000354）等活性成分的度值较高。

2.3PPI网络和核心靶点黄芪柴胡干预肝炎的PPI网络。见图3。网络包括41个节点、390条边，节点大小及其颜色根据Degree值排序，Degree值越高，则节点越大、颜色越暗;边的粗细和颜色根据Combined score排序，Combined score值越高、边越粗、颜色越暗。网络拓扑学参数度值中位数为21，中介中心性中位数为0007，接近中心性中位数为0677，VEGFA、IL6、TP53、JUN、MAPK8、MAPK1、PTGS2、EGFR、CCL2、ESR1等19个靶点满足上述参数值，作为本研究的核心靶点。见表2。

2.4分子对接结果通过Autodock vina软件计算获得的最低结合能结果。见图4。大部分关键活性成分与核心靶点蛋白的最低结合能≤-5 kal/mol，说明二者具有较好的结合活性。利用PyMol软件对

对接结果进行可视化，部分分子对接模式，黄色虚线代表氢键，图中活性成分能与周围核心靶点蛋白残基通过氢键等分子间作用力形成较稳定的构象。见图5。

2.5富集分析及化合物靶点通路网络基于R语言对潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，显著性排名靠前20的结果，GO功能富集分析富集到2 412个GO条目，主要涉及氧化应激反应、对脂多糖的反应、炎症反应、肝再生、细胞增殖等。共富集到54条KEGG通路，主要涉及TLR、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、PI3K/AKT、MAPK、IL17、TNF、HIF1等信号通路。见图6。化合物靶点通路网络共有75个节点和312条边，粉色节点代表KEGG通路，蓝色节点代表靶点，紫色节点黄芪独有的活性成分，红色节点代表柴胡独有的活性成分，黄色节点代表柴胡和黃芪共有活性成分。网络包括了20条KEGG通路、25种活性成分和30个靶点。见图7。

3讨论

本研究发现，黄芪柴胡的活性成分中，槲皮素、山柰酚、芒柄花素、美迪紫檀素、异鼠李素等活性成分作用靶点较多，在PPI网络中占据关键地位。研究发现，槲皮素能通过上调非酒精性脂肪肝炎模型大鼠脂肪细胞衍生激素脂联素（ADPN）、脂联素受体2（Adipo R2）表达，有效改善肝功能、血脂，改善大鼠肝组织脂肪变程度，减轻肝脏炎症[8]。山柰酚具有改善乙酰氨基酚引起的急性肝损伤的作用，其分子机制与抗氧化应激，促进乙酰氨基酚二相代谢和抑制炎症有关[9]。异鼠李素对由药物引起的肝细胞损伤具有良好的保护效果，可显著提升由对乙酰氨基酚引起损伤的肝细胞存活率，提升肝损伤模型中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶含量[10]。

通过PPI网络分析研究可知，VEGFA、IL6、JUN、MAPK8、MAPK1、PTGS2、EGFR、CCL2等靶蛋白的度值高，是黄芪柴胡干预肝炎潜在靶点蛋白PPI网络的核心靶点，也是其他节点之间的连接纽带。分子对接模拟进一步验证了关键药效分子与核心靶点蛋白之间的结合活性，印证了上述靶点在网络中的重要性。血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知作用最强、特异性最高的血管生成调控因子[11]，VEGFA的表达程度与肝组织损伤密切相关，研究发现，VEGFA在阻塞的肝窦缘、扩张的肝窦周围表达增强，在肝细胞坏死及血管周围炎症区阳性，在水样变性的肝细胞中强阳性表达[12]。IL6是体内重要的炎症介质，可促进肝内炎症反应，介导肝细胞损伤，诱导各类细胞分化增殖，使慢性肝脏炎症持续存在，不断刺激纤维组织增生[13]，临床研究显示，慢性乙肝患者血清IL6水平明显升高[14]。JUN的激活与乙肝病毒的发展密切相关，正常肝组织中JUN为低水平表达，但在整合乙肝病毒遗传信息的肝纤维化和肝癌细胞组织中高水平表达[15]。研究表明，表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂能通过下调信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）磷酸化来抑制乙型肝炎病毒[15]。趋化因子配体2（CCL2）主要趋化单核细胞、记忆性T淋巴细胞和自然杀伤性细胞，使各种炎症细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集在炎症反应、新生血管生成、损伤修复中均有重要作用[16]。

富集分析和通路分析结果表明，靶点主要涉及活性氧代谢过程的正调控、核质转运的正调控、DNA结合转录因子活性的调节、平滑肌细胞增殖的调节、再生、成纤维细胞增殖等生物过程。此外，本研究中药物关键靶点主要富集的通路为TLR、PI3K/AKT、MAPK、IL17、TNF等通路，这些通路与肝炎的形成和发展相关，参与肝脏炎症、肝脏纤维化以及细胞凋亡等病理学过程。表明黄芪柴胡干预肝炎活性成分作用的靶点或分布于不同的通路，通过协调各通路发挥作用。研究表明，乙肝病毒逃避宿主先天性免疫可能是由于Toll样受体（TLR）不能识别该病毒。在急性乙肝病毒感染过程中，TLR激活能阻断乙肝病毒复制[17]。IL17在多种炎症反应、免疫介导的慢性乙型肝炎及自身免疫性疾病中发挥作用[18]，参与并激活IL6/STAT3信号途径来影响慢性乙型肝炎炎症的发展[19]。TNF是调节细胞生长、分化、诱发炎症和调控细胞凋亡的因子，当机体发生免疫反应和免疫损伤时，单核巨噬细胞可以合成大量的TNFα，并通过激活免疫级联反应起到引发炎症反应的作用[20]。

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（2021-01-26收稿本文编辑：魏庆双）

基金项目：河北省中医药管理局科研计划项目（2020080）

作者简介：高云霄（199510—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医内科脾胃病，Email：2285410658@qqcom

基金项目：国家自然科学基金项目（81973733）

作者简介：周怡驰（199201—），女，博士研究生在读，医师，研究方向：中医药防治慢性肝病的临床与基础研究，Email：youhuichi@yeahnet

通信作者：胡世平（196505—），男，博士研究生，主任医师，研究方向：中西医结合防治肝病的临床与基础研究，Email：szhushiping@21cncom