李承秀， 程甜甜， 燕语， 孙忠奎， 乔谦,3， 于永畅,4， 张林*

(1.泰安市泰山林业科学研究院，山东 泰安 271000； 2.泰安时代园林科技开发有限公司，山东 泰安 271000；3.山东省果树研究所，山东 泰安 271000； 4.泰山学院，山东 泰安 271000)

流苏(Chionanthusretusus)为木犀科流苏属落叶乔木，又名糯米条、糯米茶，树形高大优美，枝叶茂盛，初夏满树白花，如覆霜盖雪，清丽宜人，秋季满树金黄，别有一番景致，适宜在园林绿地观赏，同时具有入药和制茶等多种价值，也常作为嫁接桂花的砧木[1-3]。流苏是我国珍贵的乡土树种，为国家二级保护植物，在我国生态地理分布广，主产黄河中下游及以南地区，遍布甘肃、陕西、山西、河北、山东、河南、云南、四川、广东、福建、台湾等地[1,4-6]，潜在种质资源丰富，自然变异类型多，但目前开展的现代育种工作较少，选育的园艺品种较少，主要有春雪[7]、扭叶流苏[8]，以及产于台湾的变种齿叶流苏[9]。由此可见，加强种质资源创制与新品种培育对于流苏相关研究与产业发展尤为迫切。

多倍体育种受到广大育种家的重视，多倍化可以增强植物的适应性和竞争力，表现出粗大、健壮、抗逆性强等特性。1937年秋水仙素诱导植物多倍体之后，有关多倍体诱导成功的报道层出不穷[10-11]，在蔬菜、作物、果树、花卉[12-15]中应用较广，也逐步应用到杨树、橡胶树、桑树等林木倍性育种工作中[10]，但在园林绿化树种中应用较少，尚未见到关于流苏多倍体育种的研究报道。因此，本研究以前期紫薇[16]、青檀[17]等树种的多倍体育种研究为基础，开展流苏多倍体育种试验，以期获得流苏的优异种质资源，拓宽培育流苏新品种的有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2015—2017年在泰山林业科学研究院温室内进行。供试材料来自泰安市乡土观赏树种国家林木种质资源库的流苏L-7单株种子。

1.2 方法

1.2.1 多倍体诱导

试验采用化学诱变与负压相结合的形式。将上年秋季收集的流苏种子沙藏，于翌年春季挑取刚露芽的幼苗，将其置于装有秋水仙素的培养皿中，并将培养皿置于负压泵内，在95 kPa负压条件下处理一定时间，处理结束后种植于50孔的穴盘中，待幼苗长到4～5片叶时移栽上盆。秋水仙素浓度设为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%，负压时间设为5、10、15 min，每处理100株，重复3次。

1.2.2 多倍体鉴定

参照青檀多倍体鉴定方法[17]。摘取待测流苏叶片，采用流式细胞仪对样品染色体倍性进行鉴定，采用常规茎尖压片法对二倍体及疑似四倍体流苏幼苗茎尖染色体数目进行鉴定，在ZEISS光学显微镜下观察并成像。

1.3 统计

统计幼苗死亡数与形态变异株数，以未处理为对照，将叶片粗糙、变厚、叶色加深、植物矮小[14,17]视为变异植株。试验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素对流苏幼苗的诱导效果

不同浓度秋水仙素和负压时间处理对流苏的成活率和形态变异率产生不同程度的影响。表1显示，0.2%秋水仙素浓度处理的死亡率与对照间无显著差异，随着浓度的升高，死亡率明显升高，浓度大于1.0%时各处理的死亡率相比对照均呈显著性差异，其中，1.4%浓度、负压15 min处理下的死亡率达到最高。

与死亡率的规律不同，形态变异率呈现先升高后降低的趋势。在1.0%浓度、负压10 min处理下达到最高值，随着浓度的升高，变异率降至与对照相同的水平。

就负压时间来看，在相同秋水仙素浓度处理下，死亡率与负压时间未表现出明显的变化关系，而10 min负压处理时的形态变异率最大。综合考虑认为，流苏多倍体诱导应以0.6%～1.0%浓度的秋水仙素及负压10 min为宜。

表1 不同秋水仙素浓度和负压时间对流苏 幼苗的诱导效果

2.2 变异植株DNA含量和细胞染色体数目的鉴定

采用流式细胞仪对二倍体流苏植株和疑似四倍体的植株进行细胞DNA含量检测。

图1显示，二倍体植株在相对荧光强度为40时达最高峰，疑似四倍体植株在相对荧光强度为80时具有最高峰，表明其细胞中DNA含量较普通二倍体增加1倍，由此可初步判定该植株为四倍体流苏。

图1 不同倍性流苏流式细胞仪鉴定

为进一步确定疑似四倍体植株的倍性，采用常规压片法对流苏普通二倍体植株和诱导产生的疑似四倍体植株进行茎尖染色体检测(图2)。经染色体计数鉴定，普通二倍体植株染色体数目为2n=2x=46，疑似四倍体植株为2n=4x=92。通过2种方法，从109株形态变异植株中鉴定出4个四倍体植株，其余均为二倍体，四倍体变异成功率仅3.67%。

图2 不同倍性流苏茎尖染色体观察

2.3 变异植株形态特征差异

将诱导产生的四倍体流苏与普通二倍体流苏同时移栽至保护地种植。图3显示，两者在外部形态上具有明显差异。四倍体植株整体表现为植株高大、叶片变厚、叶色加深、茎秆粗壮等特点。同一叶位，四倍体植株的叶片明显大于二倍体植株，叶色明显变深，叶片也明显变厚，革质化程度高。二年生植株的同一位置上，四倍体植株茎粗为1.1 cm，而二倍体植株仅0.5 cm；四倍体植株的芽鳞明显膨大，皮孔较二倍体变得大而稀疏。

图3 不同倍性流苏形态特征

3 小结与讨论

大量研究表明，利用秋水仙素可成功诱导多倍体的产生，且已广泛应用于植物新品种培育中，尤其是农作物的倍性育种中，也是林木与花卉新种质创制的重要手段，如红掌、彩色马蹄莲、非洲菊、杨树、桑树、橡胶、刺槐、桤木、桦木、相思、枸杞、杜仲等[10-11,15,18-19]。本课题组前期采用秋水仙素处理青檀[16]、紫薇[17]也均成功获得多倍体植株。目前，秋水仙素人工诱导多倍体多采用茎尖连续点药的方法[20-21]，表明此法较大程度降低了幼苗成活率，且需连续多次点药，费时费工。基于前期工作的经验，本试验采用化学诱变与负压相结合的方法处理流苏幼苗，结果表明，可有效降低幼苗死亡率，流苏死亡率最高仅为12%，且时间短，仅需10 min负压即可有效获得变异植株。可推广应用于植物倍性育种工作中，尤其适用于野生珍稀濒危植物的种质创制。

本试验也存在不足之处。通过对变异率的计算认为，秋水仙素适宜浓度为0.6%～1.0%，需对施药区间进一步细化，探索最佳浓度。同时，本试验所得最高变异率(6.67%)远低于紫薇(40%)[16]、青檀(34.2%)[17]、茶树(40%)[22]、山杨(33.3%)[23]等林木普通点药处理，与香樟(12%)[24]、皱皮木瓜(9.09%)[25]、枣树(4.33%)[26]等相当，物种类别与施药方法是否为导致差异之大的主导因素还需深入探究，并提出相应的解决措施，从而提升此方法诱导多倍体的成功率。

与普通二倍体相比，多倍体常具有巨大性的特点，如茎秆粗壮，叶片、果实、种子等比较大。本试验所得四倍体流苏也具有巨大性特点，同时期四倍体流苏植株在外部形态上明显大于二倍体植株，且长势旺。据Frary等[27-28]报道，一些基因具有等位剂量效应，这些基因的高水平表达会导致植物叶、花、果的增大，四倍体流苏的巨大性可能与其内部某些基因的高水平表达有关，具体还需进一步研究确定。同时，四倍体常表现出优于二倍体的抗逆性。流苏作为一种珍贵的乡土树种，常应用于荒山造林中，若四倍体流苏能体现出更强的抗逆性，可极大的提高造林成活率与绿化率，降低造林成本，对四倍体流苏的生长发育、生理特性、抗逆性等展开全面细致的研究将是下一步的工作方向。