方晓彤，范盈盈，刘峰娟，薛 鹏，康 露，田维娜，王成

(1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，乌鲁木齐 830091； 2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐)/新疆农产品质量安全重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳 550025；4. 北京电子科技职业学院生物工程学院食品技术系，北京 100176； 5.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】2019年新疆红枣总产量超370×103t，比上年增长3.2%[1]。骏枣是新疆枣类的主栽品种，有和田玉枣、阿克苏红枣和喀什大枣[2]。骏枣中不仅富含糖类、有机酸、维生素和矿物质等营养物质[3]，还有许多植物化学物质如环磷酸腺苷、生物碱、皂苷、酚酸、多糖等[4]，其所含的膳食纤维和果糖有助于调节血糖水平[5]。苯甲酸又称安息香酸、苯酸，用于制作防腐剂和定香剂[6-7]。食品中所检出的苯甲酸来源通常分为2种，一种是常见的食品添加剂，如苯甲酸钠等，用于高酸性水果、果汁的保鲜[8]，另一种是内源苯甲酸，由植物自身次生代谢或微生物作用而产生，常见于红枣、蓝莓、蔓越莓、蜂蜜、牛乳等[9]。红枣中的酚酸类物质主要存在于枣皮中，以糖苷结合的形式存在[10]，枣核和枣肉中存在的多为不溶性结合型酚酸。红枣中所检出的苯甲酸并非人为添加，而是在生长期的次级代谢过程中苯丙烷代谢所产生[11]，苯丙烷代谢生成大量酚酸，其初始物苯丙氨酸由莽草酸途径中的莽草酸经转氨作用所生成[12]，苯丙氨酸再生成反式肉桂酸、香豆酸、苯甲酸和水杨酸等酚酸[13]。红枣中生成苯甲酸的代谢途径十分重要。【前人研究进展】牟艳莉等[14]研究发现，蜂蜜中的内源苯甲酸来源于花朵，其肉桂酸侧链裂解或苄醇被氧化生成苯甲醛，再经苯甲醛转化为苯甲酸。马景友等[15]研究发现，奶酪和酸奶中的内源苯甲酸大多是由苯丙氨酸转化而成，而牛乳中的苯甲酸是由马尿酸转化而成。周晓明等[16]研究表明，产地和红枣品种都会影响其苯甲酸含量。苯甲酸是水杨酸的前体物质，水杨酸是调节植物抵抗环境胁迫的重要物质之一[17]。【本研究切入点】关于红枣中苯甲酸合成途径机理的研究较少。亟需研究3个产地不同生长期骏枣中苯甲酸及其代谢途径中相邻3种酚酸(反式肉桂酸、水杨酸、对香豆酸)的含量。【拟解决的关键问题】采用高效液相色谱-质谱联用法，测定新疆3个产地8个生长阶段骏枣中与苯甲酸及3种酚酸的含量，研究骏枣中与苯甲酸合成途径相关的酚酸变化规律，构建不同产地骏枣生长期苯甲酸合成动态变化模型，为研究红枣中内源苯甲酸合成途径提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试样品分别采摘于新疆和田地区和田县、喀什地区叶城县、阿克苏地区阿瓦提县3个枣园，分别在骏枣坐果期、幼果期、膨大期、白熟期、全熟期等不同生长时期，每14 d采1次样品进行测定，每个果园取3个重复样品。不同时期的样品取样后置于-80℃冰箱保存，后期一起测定。

试剂：苯甲酸、反式肉桂酸、对香豆酸、水杨酸标准品，纯度≥99.9%：Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈，色谱纯≥99.9%：Fisher公司；氯化钠，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；无水硫酸镁，分析纯：天津市盛奥化学试剂有限公司；0.22 μm有机滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。

设备与仪器：1290Infinity II型高效液相色谱(Agilent公司)-TSQ Quantum Ultra型三重四极杆液质(Thermo公司)联用；XSE204型分析天平(METTLER TOLEDO公司)；ST-16 gR型高速冷冻离心机(Thermo公司)。

1.2 方 法

1.2.1 标准品配置

准确称取定量的苯甲酸、反式肉桂酸、对香豆酸、水杨酸，配置成50 mg/L的标准溶液，分别吸取各标准溶液，配置成10 mg/L的混标，分析前过0.22 μm滤膜。

1.2.2 样品前处理

将新鲜红枣擦净去核后，切分，称取5.00 g，依次加入15 mL含1%乙酸的乙腈溶液(v/v)、1.5 g氯化钠和6 g无水硫酸镁，震荡5 min，5 000 r/min条件下离心1 min。取6 mL上清液，加入450 mg无水硫酸镁，75 mg PSA，震荡1 min，5 000 r/min条件下离心1 min，取上清液过0.22 μm滤膜。

1.2.3 高效液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱，规格为100×2.1(mm)，1.9 μm；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；流动相：甲醇(A)-水(B)。离子源电压：-3002 v，+3800 v；离子源温度：350℃；鞘气：35 arb；辅助气：10 arb；离子传输毛细管温度：300℃；离子源类型：电喷雾离子源。表1，表2

表1 高效液相色谱-质谱联用梯度洗脱程序Table 1 Elution by HPLC-MS/MS

表2 4种酚酸的最优质谱参数Table 2 Optimized MS/MS instrumental parameters for the four phenolic acids

注：a:对香豆酸b:水杨酸c:苯甲酸d:反式肉桂酸

1.3 数据处理

数据采用Origin 8.5软件作图，SPSS 20.0统计分析软件进行邓肯氏差异显著性分析，当P<0.05时，表示差异显著，当P<0.01时，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 3个产地骏枣中苯甲酸含量

研究表明，在0～28 d 3个地区的骏枣中苯甲酸含量较低，均低于3.00 mg/kg，其中喀什地区在第28 d苯甲酸含量最高，为2.65 mg/kg，是阿克苏地区的7.11倍，是和田地区的5.41倍。阿克苏地区和和田地区苯甲酸含量在28～42 d上升趋势较为平缓，喀什地区骏枣苯甲酸含量在28～84 d迅速增长，显著高于其他2个地区(P<0.05)。和田地区苯甲酸含量在第56 d是阿克苏地区的2.86倍，差异显著(P<0.05)。在第98 d喀什地区的苯甲酸含量为69.25 mg/kg，阿克苏地区苯甲酸含量为63.75 mg/kg，和田地区的苯甲酸含量为58.88 mg/kg，差异显著(P<0.05)，不同产地对骏枣中苯甲酸含量有显著差异。图2

图2 3个产地骏枣中苯甲酸含量Fig.2 Benzoic acid content of jujube from three producing areas

2.2 3个产地骏枣中反式肉桂酸含量

研究表明，反式肉桂酸变化趋势与苯甲酸含量相似，3个产地骏枣中反式肉桂酸含量在0～14 d持续保持较低的水平，在第28 d，喀什地区骏枣较其他2个地区呈现迅速增长趋势，3个地区显著差异(P<0.05)。和田地区骏枣反式肉桂酸含量在28～56 d呈现直线增长趋势，喀什地区含量较为平缓，但在第56 d后，喀什地区和和田地区骏枣显著下降至2.18和1.36 ng/kg。70 d后，3个地区骏枣中反式肉桂酸含量均呈现上升趋势，喀什地区骏枣增长最为迅速，阿克苏地区骏枣次之，第98 d喀什地区骏枣含量为5.34 ng/kg，阿克苏地区含量为4.83 ng/kg，和田地区骏枣含量为2.56 ng/kg，3个地区反式肉桂酸差异显著(P<0.05)。图3

图3 3个产地骏枣中反式肉桂酸含量Fig.3 Trans-Cinnamic acid content of jujube from three producing areas

2.3 3个产地骏枣中水杨酸含量

研究表明，在第14 d，和田地区骏枣的水杨酸含量为151.67 ng/kg，阿克苏地区骏枣为73.93 ng/kg，喀什地区骏枣为83.67 ng/kg，3个地区水杨酸含量差异显著(P<0.05)。在28～56 d期间3个地区水杨酸含量较为接近，变化范围不大，56 d后阿克苏地区骏枣水杨酸含量呈现迅速上升趋势，增加了12.8倍，由56 d的43.36 ng/kg增长到98 d的554.54 ng/kg，显著高于其他2个地区，3个产地水杨酸含量差异显著(P<0.05)。图4

图4 3个产地骏枣中水杨酸含量Fig.4 Salicylic acid content of jujube from three producing areas

2.4 3个产地骏枣中对香豆酸含量

研究表明，和田地区骏枣第0 d的对香豆酸含量为88.91 ng/kg，显著高于其他2地区(P<0.05)，在0～28 d迅速下降。第28 d 3个地区对香豆酸含量较为接近，28～56 d，喀什地区和阿克苏地区骏枣呈现下降趋势，和田地区呈现先上升后下降的波动趋势。56～70 d 3个地区含量较为接近，变化较小，70 d后喀什地区和和田地区骏枣对香豆酸含量缓慢上升，阿克苏地区骏枣在84 d后迅速上升。第98 d阿克苏地区骏枣对香豆酸含量为27.87 ng/kg，喀什地区骏枣为16.72 ng/kg，和田地区为15.09 ng/kg。图5

图5 3个产地骏枣中对香豆酸含量Fig.5 P-coumaric acid content of jujube from three producing areas

3 讨 论

3.1 骏枣生长过程中苯甲酸含量变化及影响因素

在研究中，骏枣在0～28 d苯甲酸含量较少，与孙屏[18]和巩志国[19]等结论一致，在青枣期苯甲酸含量较低，28 d后骏枣进入膨大期，营养物质开始积累转化，苯甲酸含量也迅速增加。3个地区中喀什地区苯甲酸含量较高，在骏枣生长0～28 d喀什白天平均气温为32.3℃，和田地区为32.0℃，阿克苏地区为31.2℃，张任等[20]研究表明，产地的气象因子对骏枣中的营养物质影响较大，平均气温就是影响骏枣关键指标的气象因子之一，Zhou等[21]研究表明，枣中苯甲酸含量与温度相关性较大，喀什地区骏枣苯甲酸含量较高与其温度有直接联系。国家标准中苯甲酸允许添加量为0.5 g/kg，FDA要求食品中苯甲酸含量不得超过食品重量的0.1%，王群霞等[22]对生长期枣中苯甲酸含量进行研究，骏枣中内源苯甲酸含量高于灰枣，其在积累转化期含量为83.0 mg/kg，孙屏等[18]对灰枣、骏枣、鸡心枣中苯甲酸含量进行研究，发现骏枣中含量最多，达到153 mg/kg，李媛等[23]对陕北及新疆地区的8种干制红枣进行研究，发现新疆阿克苏地区的骏枣中苯甲酸含量最高，为87 mg/kg，试验3个地区骏枣内源苯甲酸含量均低于70 mg/kg，远低于国家标准和FDA要求，主要原因是研究中的样品基本为成熟红枣，而骏枣苯甲酸含量随着成熟度增加逐渐积累，且干制枣中的苯甲酸含量多于鲜枣。

3.2 反式肉桂酸含量对苯甲酸含量的影响

苯丙氨酸和酪氨酸发生脱氨基反应，生成反式肉桂酸和对香豆酸[24]，反式肉桂酸进一步转化为苯甲酸和水杨酸。

以喀什地区为例，骏枣中4种酚酸含量在生长初期由多到少排列顺序为水杨酸>对香豆酸>苯甲酸>反式肉桂酸，在生长末期由多到少排列顺序为：苯甲酸>水杨酸>对香豆酸>反式肉桂酸。苯甲酸、水杨酸和对香豆酸含量总体呈现上升趋势，苯甲酸含量积累最多，上升最迅速，骏枣全熟期苯甲酸含量是坐果期的53倍，而反式肉桂酸含量则呈现下降趋势，其含量变化规律与转化途径有较强的关联性。在骏枣生长0～14 d，对香豆酸含量高于反式肉桂酸，在14 d后对香豆酸含量逐渐降低，反式肉桂酸含量逐渐上升，脱氨基反应前期生成对香豆酸较多，14 d后则主要生成反式肉桂酸，14～28 d积累的反式肉桂酸转化为大量苯甲酸，28 d后苯甲酸含量呈现快速上升趋势，56 d后部分苯甲酸转化为水杨酸，水杨酸含量逐渐增加。骏枣中苯甲酸的前体物质反式肉桂酸含量越高，其转化后的苯甲酸含量就越高。反式肉桂酸到苯甲酸的转化路径，还需要结合其代谢过程中的关键酶的活性做进一步研究。

3.3 苯甲醛含量对苯甲酸含量的影响

植物苯甲酸的合成涉及并联和交叉扩散在多个亚细胞组分的路径[25]，从反式肉桂酸到苯甲酸的合成，现已报道3种可能途径：依赖CoA型β氧化生物合成途径、依赖CoA型非氧化生物合成途径、非依赖CoA型非氧化生物合成途径[26]，苯甲醛是依赖CoA型非氧化生物合成途径和非依赖CoA型非氧化生物合成途径中生成苯甲酸的前体物质，蜂蜜中的内源苯甲酸就是由苯甲醛所转化形成。

4 结 论

不同地区骏枣中酚酸含量差异显著(P<0.05)，生长初期骏枣中内源苯甲酸含量较少，28 d后进入膨大期，苯甲酸含量逐渐增加，骏枣产地平均温度越高苯甲酸含量越高，喀什地区骏枣生长的0～28 d平均温度为32.3℃，其苯甲酸含量为2.65 mg/kg，反式肉桂酸含量越高苯甲酸含量越高，苯甲酸含量与骏枣生长时间呈现正相关变化趋势，和苯甲醛含量呈现负相关变化趋势。