竺利红， 李孝辉， 施跃峰

(浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)

黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)俗称田鸡、青蛙，属蛙科侧褶蛙属的两栖动物，因其味道鲜美、营养丰富，是有名的美味佳肴，人类对其需求量十分巨大。黑斑蛙人工养殖试验开始于2011年，2014年可摄食静态饵料黑斑蛙新品种育成，其养殖可实现全程投喂人工饲料，使产量迅速提高，养殖周期为5个月，每667 m2产量1 500～2 500 kg，每667 m2净利润可达1.5万～5.4万元，市场前景十分广阔。短短几年，养殖区域从最初的湖南省扩张至湖北、四川、江西、安徽、浙江、广东、江苏、重庆等地区。但是，随着养殖规模的扩大和集约化程度的不断提高，黑斑蛙病害频繁发生[1-3]。2018年全国养殖黑斑蛙发病率达80%以上，死亡率达50%以上，一些严重的养殖池全军覆没，不少养殖户选择退出。病害问题已成为制约黑斑蛙产业化进一步发展的瓶颈，而对其相关疾病的研究少见报道[1]。寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp.)是1993年分离出来的一个新属，属于黄单胞菌纲(Xanthomonadaceae)黄单胞菌目(Xanthomonadales)，目前该属有16个不同的种[4]。本研究从人工养殖患病黑斑蛙中进行了病原菌的分离鉴定、生物学特性研究和防治药剂筛选，旨在为从病原学角度证实蛙源寡养单胞菌的临床感染，并为其防治提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

患病黑斑蛙于2020年6月15日从浙江某黑斑蛙养殖场采集，每只体重100～150 g。主要症状为行动迟缓、身体发软、歪头，解剖发现部分病蛙有腹水。取10只具有典型症状的病蛙或濒死蛙进行病原菌分离实验。

诺氟沙星、多黏菌素B、万古霉素等38种抗菌药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；dNTPs(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×Easy Taq Buffer(1.2 mL)均购自北京全式金生物技术有限公司；5%脱纤绵羊血培养基购自成都万科生物技术有限公司。聚维酮碘购自山西华坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸铜、高锰酸钾购自湖北康盛医药科技有限公司，分析纯，有效成分99%；次氯酸购自日本株式会社；超氧水由杭州蓝海科技有限公司提供。按5种灭菌剂使用说明上的有效浓度用双蒸水配制母液，试验时由母液稀释成工作液。

1.2 病原菌的分离

在无菌条件下取病蛙脑组织、心脏、眼、肾脏、脾脏、肝脏、肺、腹水，划线接种在普通营养琼脂培养基上，37 ℃培养24～48 h。从脑组织、肝脏、肺、眼、腹水中挑取到形态一致的黄色菌落，重复划线分离纯化数次，获得12株细菌。鉴于这12株分离菌菌落、菌体形态均相似，且16S rRNA分子鉴定为同一菌种，后续研究取1号黑斑蛙腹水中的分离株Y-13进行。

1.3 人工感染试验

用接种环从菌株Y-13斜面蘸取少量菌苔到LB液体培养基中，37 ℃下200 r·min-1振荡培养18 h，离心收集菌体并重悬于生理盐水中，采用梯度稀释法测定菌液浓度并逐级稀释制备菌悬液。实验组分别以5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105和5.0×104mL-1菌悬液浓度按照每只0.1 mL背部注射，每组各30只。对照组注射等量无菌生理盐水。每天观察其症状并记录死亡数，连续观察10 d。对濒死黑斑蛙解剖，进行病原菌再分离。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 16S rRNA序列测定与系统发育分析

蘸取一环被检菌斜面，接种于20 mL LB培养基的三角烧瓶中，200 r·min-137 ℃培养过夜。收集培养后的菌液，采用上海生工的Ezup柱式基因组DNA提取试剂盒提取Y-13基因组DNA，以16S rRNA通用引物进行PCR扩增，其上、下游引物的序列分别为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。扩增体系采用25 μL的反应体系，其扩增程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后交由上海生物工程有限公司进行序列测定。测序结果与GenBank中相关核酸序列进行BLAST比对分析。选取同源性较高的序列，用MEGA 6.0软件的Neighbor-Jioning方法构建系统进化树。

1.4.2 培养与形态特性检测

进行菌株的生长温度、氧和二氧化碳需要等培养特性的测定。接种LB平板，37 ℃培养24 h后观察细菌的生长状况和菌落的大小、形态等，并革兰氏和磷钨酸染色后分别在光学显微镜和电子显微镜下观察细菌形态特征。接种于5%脱纤绵羊血培养基中，观察其溶血形态。

1.4.3 生理生化特性检测

各项生化指标的测定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。

1.5 病原菌药敏性研究

按K-B纸片扩散法将Y-13菌液涂布于LB琼脂平板上，间隔一定距离贴上药敏试纸，于37 ℃培养24 h，结果判断依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准》(第4版)进行。

1.6 灭菌剂MIC的测定

采用二倍稀释法测定灭菌剂对菌株Y-13的最小抑菌浓度。根据预实验，将各种灭菌剂依次稀释到合适浓度，即高锰酸钾：2 000、1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；硫酸铜：2 000、1 000、500、250 mg·L-1；聚维酮碘：1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；次氯酸：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1；超氧化水：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1。分别取浓度为107mL-1的Y-13菌液0.5 mL加入到装有4.5 mL灭菌剂的试管中，充分混匀静置10 min后，吸取200 μL涂布LB琼脂平板，37 ℃下培养48 h后观察有无菌落生长，无菌落生长的最小灭菌剂浓度即为MIC。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA基因分析及系统发育树构建

测序结果表明，菌株Y-13的16S rRNA基因长1 410 bp，将该序列与NCBI数据库中相应的DNA序列进行BLAST比对，与其相似度高的菌株均属于寡养单胞菌属。选取相应的模式菌株序列构建系统发育树，结果(图1)显示，Y-13与Stenotrophomonasterraestrain DSM 18941、Stenotrophomonashumistrain DSM 18929、Stenotrophomonasnitritireducensstrain DSM 12575聚在一起。因此,将菌株Y-13鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)。

2.2 菌株的表型及生理生化鉴定

该菌株在LB平板上菌落呈圆形、光滑、湿润、黄色。菌体呈杆状，直径约为0.7 mm，极生鞭毛(图2)。该菌株与寡养单胞菌属同一分支下的其他菌株(Stenotrophomonasterraestrain、Stenotrophomonashumi、Stenotrophomonasnitritireducens)相同，均表现为革兰氏阴性，无芽孢，5-酮-葡萄糖苷阴性，但是又有一定的区别[5]。Y-13可在40 ℃生长，溶血性，柠檬酸盐、明胶液化、脂酶等阴性，D-葡萄糖同化阳性(表1)。根据细菌系统进化分析及其典型的形态和生理生化特征，菌株Y-13属于寡养单胞菌属，鉴于其独特的生理生化特征，推断菌株Y-13可能是寡养单胞菌属的一个新种。

图1 菌株Y-13 16S rRNA基因序列系统发育树

图2 菌株Y-13电镜观察

表1 菌株Y-13与相近寡养单胞菌属菌株的不同表型、生理生化特征

2.3 人工感染

将不同浓度的Y-13菌液背部注射到健康黑斑蛙体内，3 d后注射菌液浓度为5×108mL-1的黑斑蛙开始出现死亡，10 d后死亡率达到100%(表2)。被感染黑斑蛙起初表现为行动迟缓、食欲减退，后期出现四肢红肿现象。有的病蛙肛门外翻出一段红色肠管，即有脱肛现象。剖检可见肠管及肠黏膜充血，严重者有出血现象(图3)，而对照组未表现出任何不良症状。采用改良的寇氏法计算菌株的LD50，菌株Y-13对黑斑蛙的LD50为7.3×106mL-1。从人工感染濒死黑斑蛙的脑脊液、眼、肝脏中均分离到大量形态、生理生化及分子特征与菌株Y-13一致的菌落，因此，认为菌株Y-13是黑斑蛙的一种病原菌。

表2 人工感染试验结果

图3 人工感染发病黑斑蛙的临床病症

2.4 药物敏感性

从表3可以看出，在供试的38种抗生素中，菌株Y-13仅对阿莫西林、美洛西林、亚胺培南、妥布霉素、恩诺沙星、吉他霉素等11种抗生素敏感，对β-内酰胺类、大环内脂类、硝基呋喃类和多肽类抗生素均有极强的耐药性，耐药率达70%以上。

表3 菌株Y-13药敏试验结果

2.5 灭菌剂MIC的测定

几种灭菌剂对菌株Y-13的抑菌效果见表4，可以看出超氧水和次氯酸的MIC最低，为12.5 mg·L-1，其次为高锰酸钾和聚维酮碘(MIC=250 mg·L-1)，效果较差的是硫酸铜(MIC=1 000 mg·L-1)。

表4 几种灭菌剂对菌株Y-13的杀灭效果

3 讨论

自2014年可摄食静态饵料的黑斑蛙新品种育成以来，短短几年时间，黑斑蛙养殖规模迅速扩大，2019年全国养殖面积达9 000 hm2，产量约10.5万t，产值超23.1亿元。为规范管理，2020年国家正式出台文件将黑斑蛙的人工养殖由渔业主管部门进行管理。预计未来5年内，其市场规模将达到30万t级别。而制约黑斑蛙产业化发展的最大瓶颈是病害问题，目前已明确的黑斑蛙病原细菌主要有米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingiamiricola)[6]、脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)[7]、气单胞菌(Aeromonassp.)[3]、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[1]等。本研究从人工养殖患病黑斑蛙中分离到1株编号为Y-13的病原菌，经鉴定归类于寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp.)，结合菌株的表型及生理生化鉴定结果，Y-13可能是寡养单胞菌属的一个新种。

目前报道的寡养单胞菌属中，嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是唯一一类被报道的人畜共患致病菌，感染后能引起脓肿、肠炎和败血症等[8-13]。菌株Y-13在血琼脂平板上出现溶血环。溶血素是细菌重要的致病因子，可引起细胞内容物外泄从而造成细胞死亡，说明本分离株毒力强。经过人工回归试验，发现菌株Y-13确有较强的致病性，能引起黑斑蛙肠炎、红腿、败血症，其半致死浓度为7.3×106mL-1。说明除了嗜麦芽寡养单胞菌以外，寡养单胞菌属还存在其他种类的致病菌，这是首次发现。至于本分离株的致病因子、传染性及对人类的潜在影响等仍有待进一步研究。

根据药敏试验结果和水产养殖用药规定，本研究筛选出2种治疗药物，分别是恩诺沙星和复方磺胺甲噁唑。但是在生产上，我们分别使用了这2种药物来治疗，效果均不理想，推测主要原因是患病黑斑蛙食欲降低甚至断食，通过饲料中添加药物的方式很难起效。因此，预防是关键，应加强养殖环境灭菌、降低养殖密度、提高黑斑蛙自身免疫力。本研究筛选出几种灭菌剂的最低抑菌浓度，还需进一步考察灭菌剂不同浓度对黑斑蛙的毒性，并进一步开展大范围的流行病学调查，深入研究蛙源病原菌的感染规律，以便指导科学用药。