叶友菊， 胡青荻， 郑坚， 马晓华， 张旭乐， 钱仁卷

(浙江省亚热带作物研究所 温州市资源植物创新利用重点实验室，浙江 温州 325005)

毛茛科铁线莲属(Clematis)植物，因花朵艳丽被誉为园林中的“藤本皇后”[1-2]，广泛应用于盆栽花卉等[3]。我国铁线莲属植物种类繁多，其中天台铁线莲为浙江特有濒危种，是浙江省重点保护野生植物[4]。天台铁线莲为平展型大花，花期一般在5—6月，花萼通常为白色[5]，花量大、花色变异丰富，极具观赏价值，且兼备药用价值，是不可多得的铁线莲育种亲本[6]。

花色素的存在及其变化是植物花色表现的化学机制，绝大多数植物累积特定的花色素种类，从而呈现出一定的花色表型，与花色的深浅程度密切相关[7]。近年来，随着测序技术的高速发展，植物育种研究也有了新的思路和手段，基于组学分析植物花色素苷的合成与调控已成为植物花色素苷新的研究方向[8-9]。邓娇等[10]基于转录组测序揭示双色花莲大洒锦花色形成机理；潘新怡[11]基于组学对紫花苜蓿花色相关基因进行了挖掘与鉴定；赵君等[12]通过代谢组学对向日葵不同花色物质组成进行分析。不难发现，组学已经成为目前植物花色研究的热门方向。

本课题组在天台铁线莲引种驯化过程中发现了花萼呈现白色和紫色相间以及花萼全部为蓝紫色的多个变异植株，且在连续3个开花周期的观察下都呈现稳定的花色性状，该发现不仅为铁线莲增加了重要的花色种质资源，也为研究铁线莲花色变异形成机制提供了理想的材料。为了进一步探究影响花色素形成的机制，我们利用天台铁线莲的白色原种和花色变异材料进行了转录组测序，通过GO和KEGG富集及功能注释，挖掘可能参与花色变异的差异表达基因，为阐明天台铁线莲的花色变异机制提供基础资料，同时对于了解其余种类铁线莲花色的形成以及培育也具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用试验材料为浙江省温州市的浙江省亚热带作物研究所国家铁线莲种质资源库保存的天台铁线莲，选取花色为白色(TTCB)的原种、花萼呈现淡紫色相间(TTJD)、紫色相间(TTJ)、蓝紫色相间(TTJZ)以及花萼全部为蓝紫色(TTSZ)的变异植株为试验材料(图1)。所选植株为同一生长环境下同一物种的不同变异，无病虫害。采样时设3个生物学重复，新鲜采集的花朵立即用液氮速冻处理，然后储存在-80 ℃用作RNA提取。

图1 不同花色的天台铁线莲材料

1.2 方法

1.2.1 文库构建与转录组测序

天台铁线莲花萼研磨在液氮条件下完成，选用植物RNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)进行RNA提取。RNA浓度和纯度(D260/D280≈2.1，D260/D230>1.8)的检测通过NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo，USA)完成，之后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测分析RNA的完整性。样品检测合格后，利用RNA文库试剂盒进行mRNA纯化及文库构建(NEB，USA)，样品的测序由美吉生物科技有限公司Illumina HiseqTM4000完成。

1.2.2 转录组数据处理及分析

Raw reads进行过滤处理后得到Clean reads。由于天台铁线莲没有相应的参考基因组序列，本研究采用de novo组装方法，使用Trinity软件对Clean reads进行组装，之后利用Tgicl对转录本聚类去冗余，得到unigene作为后续分析的参考序列。采用fold change≥2.00、adjustedP≤0.05的方式筛选差异基因，差异基因的表达丰度用FPKM值表示。采用Blast2GO软件对筛选到的DEGs进行GO富集分析并进行GO功能统计[13]。基于KEGG注释结果，利用KOBAS 3.0对检测到的差异基因进行pathway富集分析[14]。

2 结果与分析

2.1 RNA-Seq测序数据统计分析

天台铁线莲白花和深紫花各设3个生物学重复，共构建15个cDNA文库，基于Illumina HiseqTM4000测序获得的数据详见表1。经过滤筛选后共获得了136.03 Gb的clean data，每个样品获得6 Gb左右的clean data，其中Q30的占比超过92%，GC含量均在45%以上(表1)。

表1 转录组测序数据

2.2 样品主成分分析

为了进一步了解多个花色变异品种的关系，我们对样品进行了主成分分析。结果表明，淡紫色相间(TTJD)以及紫色相间(TTJ)的花与原种白色(TTCB)的花差异较小，而在花色呈现蓝紫色之后，与白色(TTCB)的花差异则明显增大(图2)。这一现象也与天台铁线莲花色性状一致。

图2 样品主成分分析

2.3 差异表达基因分析

为进一步探究天台铁线莲花色变异机制，我们构建了韦恩图，结果表明，17 550个基因在所有花色中都表达(图3)。对差异表达的基因进行统计，发现白色花(TTCB)和蓝紫色花(TTSZ)之间存在最多的差异基因，数量高达24 016个，其中11 543个基因发生上调，12 473个基因发生下调，其次是淡紫色相间的花(TTJD)和蓝紫色花(TTSZ)、紫色相间的花(TTJ)和蓝紫色花(TTSZ)以及蓝紫色相间的花(TTSZ)和蓝紫色花(TTSZ)之间的差异基因。

2.4 差异表达基因GO分类

差异表达基因GO分类统计分析结果表明，天台铁线莲花色变异的DEGs主要富集在生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)(图4)，这些结果对于花色的形成和变异具有重要的指导意义。在TTCB 与 TTJ的富集结果中，DEGs主要富集在生物合成和代谢过程方面，而在TTCB与TTJD、TTCB与TTJZ和TTCB与TTSZ的富集结果中，DEGs主要富集在代谢过程方面。在TTCB 与 TTSZ的富集结果中，BP中的不饱和脂肪酸代谢过程(GO:0033559和GO:0006636)、一元羧酸代谢过程(GO:0072330)显著富集，MF中的萜烯合成途径(GO:0016835)和柠檬烯合成途径(GO:0010333)显著富集，说明这些都参与到花色变异的机制中。

图3 不同花色的差异表达基因分析

图4 差异表达基因的GO富集

2.5 差异表达基因KEGG富集分析

进一步通过KEGG富集分析表明，在TTCB与TTJ的富集结果中，DEGs主要富集在生物合成和代谢过程方面，而在TTCB与TTJD、TTCB与TTJZ和TTCB与TTSZ的富集结果中，DEGs主要富集在代谢过程方面。不难发现大多数DEGs显著富集在萜类生物合成、氮代谢、吲哚生物碱生物合成、生物素代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢途径(图5)。此外，对天台铁线莲花色影响最为重要的花青素合成途径，在TTCB与TTSZ中达到最多的差异基因数量(17个)，而在TTCB与TTJD、TTCB与TTJ和TTJ与TTSZ中分别是6、10和16个，表明随着花色差异增大参与花青素合成的差异基因越多。

图5 差异表达基因的KEGG富集

3 讨论

花色是观赏植物重要的性状指标，铁线莲作为我国重要的观赏类植物，如何培育花色丰富的铁线莲新品种是铁线莲育种者一直以来追求的目标，因而了解铁线莲花色形成及变异的分子机理显得尤为重要[15-17]。影响植物花色的因素有很多，包括光照、水分和温度等外部环境因素，但是最主要的还是由基因决定其呈色[18-19]。从分子层面对不同性状之间基因差异进行分析成为主要研究方向之一[20-21]。随着近年来高通量测序技术高速发展，转录组测序在植物分子研究中得到广泛的应用。

本研究以天台铁线莲的白花为对照组，多个花色变异品种为试验组，进行转录组测序，并获得136.03 Gb的clean data。差异基因统计分析表明，天台铁线莲的白色花和蓝紫色花存在最多的差异基因，高达24 016个，且这些差异基因主要富集到代谢过程中。进一步对差异表达基因KEGG通路富集结果进行分析，发现TTCB与TTSZ在花青素合成途径中富集到最多的差异基因(17个)，TTCB与TTJZ存在16个差异基因，而TTCB与TTJD和TTCB与TTJ中分别仅有6和10个。结合PCA分析，可以发现随着蓝紫色物质的积累，与白色花的差异越来越大，而这些差异基因可能也是造成天台铁线莲花色存在差异的重要原因(图2)。徐建等[22]通过对矮牵牛基因组进行生物信息学分析及F3′5′H基因的功能鉴定，发现F3′5′H基因促使转基因后代的矮牵牛花瓣呈现紫色；洪燕红等[23]发现，在红花草莓中FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通过调节FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表达来调控花瓣色泽的形成。在本研究中，通过转录组测序结果可以发现白色和蓝紫色花之间存在着较多的差异基因，其花青素合成途径中也存在着较大的差异，但具体机制还需要进一步的研究[24]。