●刘玉太 车利锋 吴桥兴 赵泽明 朱奇峰 金学林※※

（1.陕西省动物研究所 陕西 西安 710032；2.陕西省秦岭珍稀濒危动物保育重点实验室 陕西 西安 710000）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）属黄病毒科瘟病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒[1]。该病毒主要感染牛、羊、猪、鹿、骆驼及许多野生动物，BVDV感染可造成易感动物腹泻、高温、白细胞减少、黏膜糜烂和脱落等临床症状[2]，该病在幼畜中传播迅速，感染率和发病率均较高，还会造成孕畜流产，产死胎、木乃伊胎、畸形胎和繁殖机能障碍等。

牛 轮 状 病 毒（Bovine rotavirus，BRV）由Bishop等于1973年发现，属呼肠病毒科轮状病毒属，大小为60～80 nm，无包膜和多层核衣壳的RNA病毒[3]。该病毒主要感染1周龄内幼畜，其中犊牛最为易感，表现为水样腹泻和严重脱水，严重时出现血便，成年牛感染后多呈隐性经过[4-5]。

牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）属于冠状病毒科乙型冠状病毒属2a亚群，是一种有包膜、不分节段的单股正链RNA病毒[6]。感染该病毒会引起犊牛腹泻、成年牛冬痢和肺炎等呼吸道疾病[7]。1周龄幼畜最易感染该病毒，导致其出现严重的出血性腹泻、严重脱水和代谢性酸中毒[8]。

陕西省具有悠久的梅花鹿养殖历史，20世纪50年代，西安蓝田、长安、周至等县开办了国营梅花鹿饲养场。目前省内饲养梅花鹿的各类企业有50余家，总存栏5000余只，陕南、关中、陕北均有分布。2020年5月，人工饲养的梅花鹿、马鹿首次被列入《国家畜禽遗传资源品种目录》，调动了陕西畜牧从业人员饲养梅花鹿的积极性，梅花鹿养殖业正逐渐成为陕西农村农民脱贫致富的重要产业。BVDV、BRV、BCoV感染鹿群不仅会降低养殖户的收益，还会影响梅花鹿养殖业的健康发展。本研究通过采集梅花鹿肛拭子样品，使用反转录PCR技术对3种病毒感染情况进行检测，为陕西省梅花鹿BVDV、BRV和BCoV的防控提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年5月至6月，在陕西省具有代表性的4个养鹿地区的6个鹿场采集梅花鹿肛拭子共61份（汉中2个梅花鹿场、安康1个梅花鹿场、商洛1个梅花鹿场、咸阳2个梅花鹿场），低温运输至实验室，-80℃冻存备用。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol购自美国Thermo Fisher Scientific公司；反转录试剂盒购自美国Promega公司；Random primer购自北京康润诚业生物科技有限公司；dNTP 2.5 mol/L购自宝日医生物技术（北京）有限公司；2×PCR MasterMix购自北京聚合美公司；DEPC水购自西安赫特生物公司；PCR仪（GT19612）购自杭州柏恒科技有限公司；高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；涡旋振荡器购自美国Scientific Industries公司；超净工作台购自北京科伟永兴仪器有限公司；电子天平购自余姚市金诺天平仪器有限公司。

1.3 BVDV、BRV、BCoV抗原检测方法

1.3.1 样品处理将肛拭子样品从-80℃环境中取出，置于4℃条件下解冻。解冻后的肛拭子样品置于已灭菌的1.5 mL离心管中，每管加入1 mL PBS，涡旋5 min，离心后各取上清液500 μL置于新的离心管中备用。

1.3.2 总RNA提取上清液中各加入500 μL的Trizol溶液，充分混合均匀，加入200 μL的氯仿，盖紧离心管剧烈摇荡15 s，冰上静置2 min。4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液置于新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10 min，-80℃放置1 h。4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 mL的75%乙醇，颠倒混匀。4℃，7500 r/min离心5 min，弃上清，4℃，12000 r/min空离1 min，用20 μL的移液器吸干剩余水分，室温下干燥10 min。用10 μL DEPC水溶解提取的RNA。

1.3.3 RNA浓度测定利用Nano测定仪测定样品总RNA浓度和A260/A280比值，RNA浓度≥100 ng/μL，比 值 在1.8～2.0间 视 为RNA样 品合格。

1.3.4 cDNA反转录用两步法进行反转录，第一步70℃变性5 min，之后立即冰浴放置2 min。第二步37℃ 60 min，-20℃保存。两步法反转录体系，见表1。

表1 反转录体系

1.3.5 引物设计BVDV、BRV、BCoV病毒基因扩增引物由上海生工合成。均按要求各自加入相应ddH2O，吹打混匀制成母液（100 μmol/L），再取10 μL母液置于新的1.5 mL离心管中，加入90 μL ddH2O 稀释，制成工作液（10 μmol/L）。扩增引物，见表2。

表2 3种病毒基因扩增引物

1.3.6 PCR扩增将RNA反转录得到的cDNA按15 μL体系进行PCR扩增，体系组分，见表3。BVDV反 应 条 件 为94℃ 5 min；94℃ 30 s，47℃30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 7 min。BCoV、BRV反应条件为95℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个 循 环；72℃ 10 min。PCR结束后，BVDV使用3%琼脂糖凝胶电泳检测，BRV、BCoV使用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测。

表3 PCR反应体系

2 结果与分析

使用反转录PCR技术对陕西省四地6个鹿场的61份梅花鹿肛拭子进行BVDV、BRV、BCoV感染情况检测，部分代表性结果见图1、图2和图3。61份样品中BVDV阳性样品0份，BRV阳性样品0份，BCoV阳性样品0份。

图1 梅花鹿肛拭子BVDV检测代表性结果

图2 梅花鹿肛拭子BRV检测代表性结果

图3 梅花鹿肛拭子BCoV检测代表性结果

3 结论与讨论

腹泻是梅花鹿饲养过程中的常见病和多发病，占梅花鹿病例的50%～60%，临床上以排便次数增加和粪便不成形为典型症状[9]。根据发病原因不同，可将梅花鹿腹泻病分为两大类，一类是由营养、环境、管理、应激等因素造成的非传染性腹泻病，另一类是由细菌、病毒、寄生虫等致病源感染引起的传染性腹泻病，其中以病毒引起的病毒性、传染性腹泻病发病率最高，危害最为严重。BVDV、BRV和BCoV是3种常见的可引起动物病毒性腹泻的病毒。

BVDV感染梅花鹿并引起疾病反应已在多篇文献中被报道。Doyle[10]调查了45种野生反刍动物，发现鹿科动物的血清中抗体阳性率达28%。王新平等[11]证实了我国鹿群存在不同程度的BVDV感染，其中育成梅花鹿的带毒率为34.1%。杜锐等[12-13]调查显示，幼鹿群中BVDV感染率达60.0%～86.7%，并在鹿腹泻粪样中检测到BVDV粒子。郜玉刚等[14]从梅花鹿流产胎儿病料中分离出了BVDV病毒，并命名为CCSYD株。孟日增等[15]采用夹心ELISA方法检测鹿群的BVDV感染情况，阳性率为32.5%。可见，BVDV已成为危害养鹿业的重要病原之一。虽然我国鹿群内BRV和BCoV的感染情况尚无文献报道，但国外的研究表明，BCoV和BRV可跨种感染鹿科动物。Alekseev等[16]对包括水鹿、白尾鹿在内的4种野生反刍动物粪便内的冠状病毒基因进行测序分析，发现其核苷酸序列与BCoV相似度达99.4%～99.6%，并且认为牛可能是鹿等野生反刍动物冠状病毒感染的传染源，反之亦然。Kim等[17]采集了77只野生水鹿的鼻拭子，其中3只表现BCoV阳性。Yokoi等[18]报道了日本179只驯养的梅花鹿BCoV阳性率为1.1%。Kim等[19]发现野生水鹿体内轮状病毒的阳性率为2%。Romano等[20]在挪威和瑞典的驯鹿体内检测到了BRV。Shibahara等[21]通过免疫组化技术在一只由腹泻致死的5月龄驯鹿肠道组织中检测到BRV。总之，BVDV、BRV和BCoV可通过牛等家畜跨种传播感染梅花鹿，造成鹿群腹泻、消瘦甚至死亡等临床症状，危害梅花鹿养殖产业。

本研究中，陕西省内的梅花鹿样品BVDV、BRV和BCoV感染调查结果全部为阴性，一方面可能与本研究采集的样品数量少有关，另一方面在一定程度上反映陕西省的梅花鹿鹿群BVDV、BRV和BCoV防控效果良好。但是梅花鹿养殖人员对这3种病毒的防范仍然不能忽视，尤其是牛羊养殖发达的关中、陕北地区。

本研究中陕西省的梅花鹿样品BVDV、BRV和BCoV感染调查结果虽全部为阴性，但样品阴性并不代表鹿群不存在这3种病毒。随着陕西省梅花鹿产业的迅速发展，梅花鹿养殖密度增大，鹿群之间交易频繁，必然会增大BVDV、BRV和BCoV的感染概率。目前，这3种病毒引起的腹泻性疾病均无有效的治疗和免疫方法，且常存在混合感染情况，给临床诊断治疗增加了难度。因此，加强检疫和净化工作，重视区域性防控，对防范梅花鹿群感染BVDV、BRV和BCoV具有重要意义。