王彬彬，李秋果，于景金，杨志民

（南京农业大学草业学院, 江苏 南京 210095）

土地盐渍化是伴随着自然和人类活动而出现的全球性生态问题之一[1]。近年来，中国盐碱地面积也不断扩大，总面积达到了3.6 × 107hm2[2]。此外，许多城市为节约用水而使用循环水浇灌草坪绿地，造成了土壤次生盐害问题，从而使得草坪草受到严重的盐胁迫[3]，这在一定程度上影响了草坪的质量、生态和景观效果。目前，提高草坪草耐盐性的方法大致有两种：通过人为管理的方式改善草坪草的耐盐性或者筛选培育耐盐的草坪草新品种。其中，外源物能够有效提高植物的抗逆性，具有简便、有效、低成本等特点[4-5]，所以可通过外源喷施的方法提高草坪草抗盐性。

在当前研究中，植物生长调节类物质、渗透调节物质和非酶促抗氧化物质是用于提高植物抗逆性的主要外源物种类[6]。其中，外源施用钾、甜菜碱(glycine betaine, GB)和抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)可以缓解植物的盐害。钾是植物生长必需的营养元素之一，在草坪草生长发育过程中发挥着重要的营养和生理作用[7]。盐胁迫下施加适量的K+有利于维持植物的细胞膜稳定性，显著提高抗氧化酶的活性以及渗透调节物质的积累[8-10]。甜菜碱是植物在逆境下合成的一种渗透调节物质，高等植物包括禾本科在内的28 个科中均含有甜菜碱[11]，其能够提高植物对多种非生物胁迫的抵抗能力[12]。在盐胁迫下，外源甜菜碱可在一定程度上维持细胞的正常膨压和生理代谢，从而增强紫花苜蓿(Medicago sativa)的抗盐能力[13]。抗坏血酸是一种广泛存在于植物体内的抗氧化剂，在盐胁迫下通过调节活性氧平衡以提高植物耐盐性[14-15]。

匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)是一种多年生冷季型草坪草，具有耐寒、耐低修剪等诸多优良特性，其耐盐性相对较强[16-17]，但盐胁迫仍然会明显抑制匍匐剪股颖的生长[18]。目前，通过外源施用硫酸钾(K2SO4)和AsA 提高大豆(Glycine max)[19-20]、多年生黑麦草(Lolium perenne)[21]和高羊茅(Festuca arundinacea)[22]等作物的耐盐性研究已有报道，也有学者研究了GB 对匍匐剪股颖抗旱性的影响[23]，但关于利用这3 种外源物提高匍匐剪股颖耐盐性方面的研究相对较少。因此，本研究选取生产上广泛应用的匍匐剪股颖‘L-93’为试验材料，在盐胁迫下分别叶面喷施一定浓度的外源K2SO4、外源GB 和外源AsA，并从离子调节、渗透调节和抗氧化调节等方面来研究匍匐剪股颖对3 种外源物的生理响应，以期为提高匍匐剪股颖耐盐性和发展高效的草坪草管理技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选取生产上常用的进口匍匐剪股颖品种‘L-93’，在南京农业大学草业学院温室大棚中进行预培养。采用种子繁殖的方法，将其播种于PVC管中(高度为50 cm，直径为11 cm)。所用基质按照菜园土与河沙1 ∶ 1 比例混合，并拌入适量有机肥。种子萌发期间保证基质时刻处于湿润状态。待幼苗长至6 cm 后按照1/3 原则进行修剪，每2 d 修剪一次，修剪高度控制在4 cm 左右。待试验材料长势良好、均匀一致时，将其移至生长室以适应理想环境半个月，而后进行试验处理。

1.2 试验设计

本试验共设置非盐胁迫(CK)和盐胁迫(salt)两个处理。盐胁迫即对匍匐剪股颖浇施250 mmol·L-1NaCl 溶液，每次浇250 mL。为避免突然盐害，盐溶液浓度每天逐渐递增50 mmol·L-1，第5 天以后每次处理的盐浓度均为250 mmol·L-1。在盐处理下喷 施 蒸 馏 水(H2O)、K2SO4(3.27 mmol·L-1)、GB (100 mmol·L-1)[24]和AsA (20 mmol·L-1)[22]4 种外源物，每个试验水平分别设置4 次生物学重复。CK 处理浇施250 mL 水，之后同样分别喷施4 种外源物，每个试验水平分别设置2 次生物学重复。所有外源物质采用雾状喷头进行喷施，每盆均定量喷施10 mL。每7 d 分别喷施一次外源物(在取样前进行喷施)，总共喷施5 次。本试验共进行35 d，每7 d 取样一次。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 抗逆指标测定

在每次取样之前，采用全美草坪草评价体系(The National Turfgrass Evaluation Program, NTEP)测定草坪质量(turf quality, TQ)[25]；叶片相对含水量(relative water content, RWC)依据Barrs 和Weatherley[26]的方法测定；叶片电解质渗漏率(electrolyte leakage, EL)采用相对电导率法测定[27]；叶片丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量的测定采用巴比妥酸显色法，并基于鲜重计算其含量[27]。

1.3.2 叶片K+、Na+离子含量测定

剪取完全展开的新鲜叶片0.6 g 左右，先用清水冲洗干净，再用双蒸水冲洗3 遍，确保去除干净叶片表面的离子。然后把样品置于纸袋后放入烘箱，经105 ℃杀青5 min 后，在80 ℃下烘干72 h 至恒重，用磨样机磨碎，取0.1 g 置于50 mL 消煮管中，加入HNO35 mL，用微波消煮的方法进行消煮30 min，消煮过后将溶液用双蒸水定容于250 mL 容量瓶，摇匀，取10 mL 于离心管中。最后配备标准溶液，用电感耦合等离子光谱发生仪(Ⅰnductively Coupled Plasma Spectrometer, ⅠCP)测定K+、Na+含量。

1.3.3 抗氧化物酶活性测定

取0.18 g 新鲜叶片，加入液氮充分研磨成粉末状，然后溶解于1.8 mL 预冷的磷酸缓冲液(0.05 mol·L-1, pH 7.8)，摇晃呈匀浆。而后在4 ℃、15 000 g下离心30 min，得到的上清液于4 ℃条件下保存，用于分别测定过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)的活性。其中，CAT 活性测定参照Aebi[28]的方法，APX 活性测定参照Nakano 和Asada[29]的方法。试验测定使用的紫外分光光度计为美国通用GE Ultrospec 9000 型。

1.4 数据处理

将所测指标的结果用Excel 2010 进行数据整理，用SPSS 进行显著性分析，用SigmaPlot 14.0 软件进行作图。显著性分析中，平均数之间选择最小显著差数法(least significant difference, LSD)进行数据分析，显著检验水平采用P= 0.05。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖草坪质量(TQ)的影响

在非盐胁迫的情况下，叶面喷施H2O 以及3 种外源物对TQ 的影响差异不显著(P＞ 0.05)；在盐胁迫下，TQ 呈现总体下降的趋势，处理期内下降了45%～70% (图1)。盐处理下喷施H2O 的处理TQ 下降最严重，而叶面喷施K2SO4后TQ 下降最缓慢，喷施AsA对盐害缓解作用稍次之。叶面喷施外源物K2SO4与叶面喷施H2O 相比TQ 间存在显著差异(P＜ 0.05)，其他处理间差异不显著(P＞ 0.05)。因此在本试验中，匍匐剪股颖叶面喷施K2SO4对盐胁迫下的草坪质量有显著的缓解和改善作用(P＜ 0.05)。

图1 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对草坪质量的影响Figure 1 Effect of three kinds of xenobiotics on the turf quality of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

2.2 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖相对含水量(RWC)的影响

匍匐剪股颖‘L-93’在非盐胁迫的情况下，叶面喷施H2O 以及3 种外源物对其RWC 的影响均不显著(P＞ 0.05)，RWC 稳定在93.5%～96.2%；盐处理明显降低了匍匐剪股颖的RWC，且随胁迫时间延长而逐次降低(图2)。与喷施H2O 相比，盐胁迫下喷施3 种外源物后RWC 下降速度减缓。其中叶面喷施外源物K2SO4或喷施AsA，其RWC 与喷施H2O 差异显著(P＜ 0.05)，这说明盐胁迫下叶面喷施这两种外源物能显著减缓匍匐剪股颖RWC 降低(P＜ 0.05)。与喷施H2O 相比，叶面喷施GB 时RWC 仅在盐胁迫21 和28 d 表现出显著差异(P＜ 0.05)，这说明叶面喷施GB 对匍匐剪股颖盐害的缓解作用不如K2SO4和AsA。

图2 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对相对含水量的影响Figure 2 Effect of three kinds of xenobiotics on the relative water content of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

2.3 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖电解质渗漏率(EL)的影响

在非盐胁迫的情况下，叶面喷施H2O 以及3 种外源物对EL 的影响不显著(P＞ 0.05)；盐胁迫对匍匐剪股颖EL 有很大影响，明显提高了其EL，在盐胁迫35 d 内EL 升高了68%～130% (图3)。在盐胁迫下，叶面喷施外源物K2SO4或喷施AsA，其EL 总体上与喷施H2O 相比表现出显著差异(P＜ 0.05)，而喷施GB 的处理其EL 仅在盐胁迫14 和35 d 时与喷施H2O 有显著差异(P＜ 0.05)。其中，外源喷施H2O的处理，EL 上升了129%；而喷施K2SO4和AsA 的处理，EL 分别上升了64%和82%。因此，本试验得出，在匍匐剪股颖叶面喷施K2SO4和AsA 对盐胁迫下的EL 有显著的缓解和改善作用(P＜ 0.05)。

图3 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对电解质渗漏率的影响Figure 3 Effect of three kinds of xenobiotics on the electrolyte leakage of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

2.4 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖丙二醛(MDA)含量的影响

在非盐胁迫下，叶面喷施3 种外源物，匍匐剪股颖的MDA 含量与喷施H2O 相比无显著差异(P＞0.05)，所测得的叶片MDA 含量均在11 μmol·g-1左右；在盐胁迫下，MDA 含量均呈现出明显上升的趋势(图4)。盐胁迫下，与叶面喷施H2O 相比，‘L-93’在经过3 种外源物喷施处理后，MDA 含量均有不同程度的减少。其中，叶面喷施K2SO4的处理MDA含量降低幅度最大，喷施AsA 的处理稍次之，而喷施GB 对降低MDA 含量的效果不明显。在处理14、21、28 和35 d 时，喷施K2SO4和AsA 处理的MDA含量均显著低于对照(P＜ 0.05)；而喷施GB 和对照相比，MDA 含量间差异不显著(P＞ 0.05)。在盐处理35 d 内，叶面喷施H2O、K2SO4、AsA 和GB，MDA含量分别上升了233%、108%、130%和185%。因此，叶面喷施外源物K2SO4和AsA，其MDA 含量总体上与外源喷施H2O 相比有显著差异(P＜ 0.05)，能有效减缓MDA 含量的升高趋势。

图4 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对丙二醛含量的影响Figure 4 Effect of three kinds of xenobiotics on the malonaldehyde content of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

2.5 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖离子含量的影响

2.5.1 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖Na+含量的影响

未经盐胁迫的匍匐剪股颖‘L-93’，其叶片Na+含量随时间改变无显著变化(P＞ 0.05)；在NaCl 处理下，匍匐剪股颖叶片Na+含量随胁迫时间的增长呈一直上升的趋势，但经过3 种外源物喷施处理后，Na+含量均出现升高减缓的趋势(图5)。盐胁迫下喷施H2O，叶片Na+含量由3.3 mg·g-1升高至47.0 mg·g-1；而叶面喷施K2SO4、AsA 和GB 后，叶片最高Na+含量分别为喷施H2O 处理的69%、82%和91%。其中，叶面喷施外源物K2SO4和AsA，其Na+含量总体上与喷施H2O 差异显著(P＜ 0.05)；而喷施甜菜碱的处理与喷施H2O 相比，Na+含量间差异不显著(P＞ 0.05)。

2.5.2 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖K+含量的影响

非盐胁迫下，匍匐剪股颖叶片K+含量随时间改变无显著变化(P＞ 0.05)；盐胁迫明显降低了叶片中K+含 量，这 表 明 盐 胁 迫 会 降 低‘L-93’对K+的 吸 收(图5)。但是，盐胁迫下‘L-93’在经过3 种外源物处理后，均能减缓K+含量降低的趋势。在盐处理35 d内，外源喷施H2O、K2SO4、AsA 和GB，K+含量分别降低了58.0%、40.1%、49.9%和47.6%。叶面喷施外源物K2SO4、AsA 和GB，其K+含量总体上与喷施H2O相比均有显著差异(P＜ 0.05)。

2.5.3 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖Na+/K+的影响

叶片Na+/K+的变化情况显示，未经盐胁迫的匍匐剪股颖叶片Na+/K+随时间的改变并无显著变化(P＞ 0.05)；盐胁迫明显升高了叶片中Na+/K+(图5)。盐胁迫下，与对照相比，‘L-93’在经过外源物喷施处理后，Na+/K+均出现升高减缓的趋势。在盐处理35 d内，喷施H2O 的处理，Na+/K+由0.043升高至1.38，提高了约31 倍；而叶面喷施K2SO4、AsA和GB 的处理，其最高Na+/K+分别比喷施H2O 的处理降低了47.8%、26.1%和26.8%。在盐胁迫下，叶面喷施外源物K2SO4、AsA 和GB，其Na+/K+总体上与喷施H2O相比均有显著差异(P＜ 0.05)。

图5 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对离子含量的影响Figure 5 Effect of three kinds of xenobiotics on the ion content of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

2.6 盐胁迫下3 种外源物对匍匐剪股颖CAT 和APX 活性的影响

匍匐剪股颖‘L-93’在非盐胁迫的情况下，叶面喷施3 种外源物与喷施H2O 相比，其CAT 和APX活性无显著差异(P＞ 0.05)；在盐胁迫下，CAT 和APX活性在盐胁迫初期受诱导呈现上升的趋势，分别在14 和21d 达到最大值，而后随着盐胁迫时间的增长而呈下降趋势(图6 和图7)。盐胁迫下，与叶面喷施H2O 相比，‘L-93’在经过外源物喷施处理后，CAT 和APX 活性均出现下降趋势减缓的现象。

图6 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对过氧化氢酶(CAT)活性的影响Figure 6 Effect of three kinds of xenobiotics on the catalase activity of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress conditions

图7 非盐胁迫和盐胁迫下3 种外源物对抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响Figure 7 Effect of three kinds of xenobiotics on the ascorbate peroxidase activity of creeping bentgrass under non-salt stress and salt stress

盐胁迫下，在匍匐剪股颖叶面喷施3 种外源物，其CAT 活性总体上与喷施H2O 相比均有显著差异(P＜ 0.05)；盐胁迫14～35 d 时，喷施H2O、K2SO4、GB 和AsA，CAT 活性分别比低于最高值60.7%、18.8%、30.0%和20.0%。但是，喷施3 种外源物对APX 活性无显著影响(P＞ 0.05)，仅在处理35 d 时，喷施K2SO4与喷施H2O 相比，叶片APX 活性表现出显著差异(P＜ 0.05)，其他处理时间上均表现为无显著差异(P＞ 0.05)。因此，本试验可以得出，匍匐剪股颖叶面喷施3 种外源物对缓解盐胁迫下的CAT 活性降低有显著作用(P＜ 0.05)，但总体上对缓解盐胁迫下的APX 活性降低无显著影响。

3 讨论与结论

3.1 3 种外源物对匍匐剪股颖水分状况的影响

在盐胁迫下，草坪草常因遭受渗透胁迫而造成吸水能力减弱，生长受到抑制[30]。水分是草坪草正常生长代谢的基础，维持植物体内的水分平衡有利于其抵抗逆境胁迫。RWC 能够反映逆境条件下草坪草组织的水分状况[31]，盐胁迫下草坪草的RWC越高，说明其耐盐性越强[32]。从测得的RWC 数据可以看出，盐胁迫导致匍匐剪股颖‘L-93’的叶片RWC 大幅下降，且随着胁迫时间的延长而逐渐降低。但是，经过外源物K2SO4和AsA 喷施后，匍匐剪股颖叶片中的RWC 下降趋势显著变慢，这表明喷施K2SO4和AsA 对改善盐胁迫下匍匐剪股颖的水分状况有促进作用。

3.2 3 种外源物对匍匐剪股颖细胞膜稳定性的影响

正常情况下的细胞质膜透性很小，盐胁迫则会破坏草坪草的细胞膜结构和通透性[33]。EL 和MDA 含量是衡量细胞膜稳定性的重要指标，与草坪草受盐胁迫时细胞膜的伤害程度呈正相关关系，与草坪草的耐盐性呈负相关关系。在本研究中，EL 和MDA 含量均随盐胁迫时间增长而逐渐升高，说明盐胁迫破坏了匍匐剪股颖叶片细胞膜的稳定性。Jan 等[10]研究发现，K+处理可显著降低MDA 含量，提高盐胁迫下小麦(Triticum aestivum)的细胞膜稳定性。此外，Nawaz 等[34]发现外源AsA 能显著减少EL 和MDA 含量，使绿豆(Vigna radiata)的耐盐性增强。与上述研究相似，在外源物质K2SO4或AsA 的作用下，匍匐剪股颖叶片EL 和MDA 值的上升速度减缓。因此，外源喷施K2SO4和AsA 可减轻细胞膜的受破坏程度，提高匍匐剪股颖的耐盐性。

3.3 3 种外源物对匍匐剪股颖离子含量的影响

盐胁迫会导致植物各离子间的平衡失调，产生离子毒害，进而影响植物正常的生理代谢活动[35]。前人研究发现，盐胁迫下水稻(Oryza sativa)和沟叶结缕草(Zoysia matrella)易吸收和积累大量的Na+，而K+的吸收则会受到抑制，表现出与Na+相反的积累趋势[36-37]。本研究也得到了相似的结果，经过盐处理后，匍匐剪股颖叶片Na+含量显著增加，对K+的吸收减少，Na+/K+升高。这有可能是由于盐胁迫所引起的离子毒害抑制了匍匐剪股颖根系的生长，从而降低了养分的吸收和转运，尤其是K+的吸收和转运。

盐胁迫下维持细胞体内的钠钾离子平衡是提高植物耐盐性的一个重要举措。高浓度的Na+积累会影响草坪草的各种生理生化反应，而降低细胞中的Na+含量有助于促进盐胁迫下草坪草的生长发育[16]。在本研究中，盐胁迫下叶面喷施K2SO4和喷施AsA，对降低匍匐剪股颖叶片中Na+的积累有显著作用，说明这两种外源物能减轻盐胁迫带来的伤害。K+既能参与植物结构的组成，还能在盐胁迫下维持离子稳态和调节渗透平衡[38]。孙婷[39]研究发现，叶面喷施K2SO4能够维持盐胁迫下紫花苜蓿钠钾离子的相对平衡。在本研究中，外源喷施K2SO4、AsA 和GB 也能显著缓解盐胁迫下K+含量的下降趋势，并降低Na+/K+。因此，喷施K2SO4、AsA 和GB 这3 种外源物质可显著改善盐胁迫下Na+、K+离子的运输情况，有利于促进盐胁迫下的离子平衡。

3.4 3 种外源物对匍匐剪股颖抗氧化酶系统的影响

抗氧化酶系统是植物体内清除过氧化氢和超氧阴离子等活性氧的一个主要途径，可避免植物受到盐胁迫下的氧化伤害[40]，其中包括过CAT 和APX等抗氧化酶。本研究中，随着盐胁迫时间的增加，CAT 和APX 活性均表现出先升高后降低的趋势。在高羊茅受盐胁迫时，其抗氧化酶活性的变化也呈现相同趋势[22]。这可能是由于在胁迫初期，抗氧化酶系统仍然能够发挥作用，但随着胁迫时间的延长，其活性逐渐受到抑制。在相同的盐胁迫下，喷施外源物K2SO4和AsA 对缓解CAT 活性的下降有显著作用。Taha 等[20]研究发现，在盐胁迫下喷施外源物K2SO4能显著提高大豆的APX 活性，而刘璐璐[21]也报道喷施AsA 能显著提高多年生黑麦草APX 活性。但本研究得到了与上述不一致的结果，喷施3 种外源物质对延缓APX 活性的下降并没有显著作用，其潜在原因还有待研究。

综上所述，叶面喷施K2SO4和AsA 可减轻盐胁迫对匍匐剪股颖造成的负面影响，主要体现在4 个方面：1)维持水分平衡；2)减轻细胞膜的受破坏程度；3)促进钠钾离子平衡；4)维持抗氧化酶系统平衡。此外，外源喷施GB 可显著提高CAT 活性，并降低匍匐剪股颖叶片Na+/K+，但对TQ 和MDA 含量的影响差异不显著，总体效果低于K2SO4和AsA。本研究为匍匐剪股颖‘L-93’在盐渍化土壤上的管理与应用提供了一定的技术参考，也为探究外源物缓解草坪草盐害的作用机理奠定了研究基础。