张萌萌，高 敏，张相敏，王雪峰*，王晓钧*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是逆转录病毒科慢病毒属的成员之一，主要感染马属动物。EIAV 引起马属动物出现反复发热、消瘦、贫血和进行性衰弱为特征的传染性疾病称为马传染性贫血病（Equine infectious anemia，EIA）。EIAV 是基因组结构最简单的慢病毒，基因组全长约8.2 kb，可以编码3 个结构蛋白（Gag、Pol和Env）和3 个附属蛋白（tat、Rev 和S2）。病毒蛋白表达调节因子（Regulator of expression of viral proteins，Rev）是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白，其主要功能是介导未经剪切的病毒基因组RNA 和不完全剪切的病毒mRNA 从细胞核运输到细胞质，从而实现病毒结构蛋白表达和病毒粒子生成[1]。通常将Rev介导病毒mRNA 核质运输的生物学功能简称为核输出活性（Nuclear-export activity）。

EIAV Rev 蛋白包括3 个主要的功能域：分别为核输出信号（Nuelear export signal，NES）、核定位信号（Nuelear loaclization signal，NLS）以及RNA 结合区域（RNA-binding domain，RBD）[2]。Rev 通过RBD 与病毒mRNA的特定序列（Rev responsive element，RRE）结合，将病毒Gag-Pol或Env的mRNA运输至胞浆，实现病毒结构蛋白的表达[3]。EIAV 的RRE 长约555 nt，具有特定茎环结构，位于env基因的N 端，与Rev 编码基因的第一外显子重叠[4]。研究表明，EIAVrev基因具有高变异性，而且rev的变异与疾病转归相关[5]。为建立EIAV Rev 的核输出活性检测方法，本研究利用Gag-Pol 的表达依赖于Rev 与RRE 结合促进其mRNA 核输出的原理，克隆了EIAV 的Gag-pol 编码区序列以及RRE，构建了真核表达载体pGagpol-RRE。由于pGagpol-RRE 单独转染HEK293T 细胞不表达，仅在Rev 的作用下才能在HEK293T 细胞中表达。所以，将pGagpol-RRE 与Rev 表达载体（pcDNARevFDDV-HA）共转染HEK293T 细胞，利用western blot 在细胞裂解液中可检测到Gag 的表达，通过检测Gag 的表达来评估Rev 的核输出活性。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞pLGFD3-8、pcDNA-HA、pcDNA-RevFDDV-HA、pEGFP-N1 质粒、HEK293T 细胞均由本实验室保存；pcDNA-RevL36A-HA 是在pcDNARevFDDV-HA 的基础上获得的L36A 突变质粒；pcDNARevUK-HA、pcDNA-RevNewmarket-HA、pcDNA-RevCornwall-HA、pcDNA-RevF2-HA、pcDNA-RevSA-HA、pcDNA-RevDEHA、pcDNA-RevMiyazaki-HA、pcDNA-RevDevon-HA、pcDNA-RevPA-HA 等不同Rev 表达质粒均由苏州金唯智生物科技有限公司按照GenBank 中各EIAV 病毒株的rev基因序列（不同Rev 基因的Genbank 登录号分别是：UK，AF016316.1；Newmarket，MH580896.1；Cornwall，MH580898.1；F2，JX48063-1.1；SA，KM24 7555.2；DE，KM247554.1； Miyazaki，JX003263.1；Devon，MH580897.1；PA，GQ855756.1）合成后克隆于pcDNA-HA 载体。E. coilDH5α 感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要试剂PolyJet DNA In Vitro Transfection Reagent购自SignaGen Laboratories公司；KOD高保真DNA聚合酶购自TOYOBO 公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；新生牛血清（FBS）购自Wisent公司；EIAV p26单克隆抗体（MAb）由本实验室保存；鼠HA MAb 购自Sigma 公司；DyLightTM800 标记的IgG 羊抗鼠购自KPL公司；蛋白Marker 购自Thermo Fisher Scientific 公司；质粒大提试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 重组质粒的构建根据EIAV 驴胎皮肤细胞弱毒疫苗（EIAVFDDV）基因组序列（GU385361.1）设计特异性引物（Nhe-Gagpol-F：5'-CTAGCTAGCATTTG GTCGCTCAGATTCTGCGG-3'/xho-Gagpol-R：5'-GGCTC GAGCATACACCAAACCTTATAACAGA-3'；xho-RREF：5'-AAACTCGAGATGGGATTATTTGGTAAAGGGGT-3'/Not-RRE-R：5'-AAAGCGGCCGCGTTACATTTATAT TTTTGACAGT-3'），以EIAV 感染性克隆pLGFD3-8为模板[6]，利用PCR 方法分别扩增基因组204 bp～5 295 bp（包含Gag-Pol 编码区及其两侧序列）和5 296 bp～5 867 bp（包含RRE 及其两侧序列）的核苷酸序列，扩增的Gag-Pol 编码区及其两侧序列的片段预期为5 091 bp；扩增RRE 及其两侧序列的片段预期为571 bp，Gag-Pol片段经NheI和XhoI双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1，构建重组质粒pGagpol。将RRE 片段和pGagpol 分别经XhoI 和NotI 双酶切后连接，构建的重组质粒pGagpol-RRE。经酶切鉴定，阳性克隆由擎科（中国哈尔滨）公司测序鉴定。

1.4 Rev 介导Gag-Pol 表达的检测及其相关性分析37 ℃、 5%CO2条件下于细胞培养板中将HEK293T细胞培养至细胞密度80%左右时，采用PolyJet DNAIn VitroTransfection Reagent 将pGagpol-RRE（1 μg）分别与pcDNA-HA（1 μg）或pcDNA-RevFDDV-HA（1 μg）共转染HEK293T 细胞，转染6 h～8 h 后弃掉培养液更换新鲜培养液，继续培养至感染后36 h 时裂解细胞，分别采用抗EIAV p26 MAb（9H8）（1∶2 000）、鼠抗HA MAb（1∶2 000）或鼠抗β-actin MAb（1∶2 000）为一抗，DyLightTM800 标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，通过western blot 检测Gag 的表达情况，分析其与Rev 的相关性。

按照上述转染方法将1 μg pGagpol-RRE 质粒分别与不同剂量（0.05 μg、0.1 μg、0.2 μg）的pcDNARevFDDV-HA 质粒和不同剂量（0.15 μg、0.1 μg、0）的pcDNA-HA 质粒共转染HEK293T 细胞，转染质粒的总剂量为1.2 μg，转染36 h后通过western blot检测Gag表达量的变化，并利用Image J进行灰度分析不同剂量的Rev对Gag-Pol表达的相关性。

此外，将pGagpol-RRE（1 μg）分别与pcDNA-HA（1 μg）、pcDNA-RevFDDV-HA（1 μg）和pcDNA-RevL36A-HA（1 μg）共转染HEK293T细胞，通过western blot检测Gag的表达情况，分析Rev介导Gag-Pol表达的特异性。

1.5 不同EIAV 毒株Rev 的序列特征及其核输出活性的检测 利用DNAStar 软件中的MegAlign 工具和GeneDoc 软件对不同毒株的EIAV Rev 序列间进行比对，分析各毒株间Rev 基因同源性。参照1.4 中转染方法将pGagpol-RRE（1 μg）分别与不同EIAV 毒株Rev表达载体（1 μg）（pcDNA-RevFDDV-HA、pcDNA-RevUKHA、pcDNA-RevNew-HA、pcDNA-RevCornwall-HA、pcDNA-RevF2-HA、pcDNA-RevSA-HA、pcDNA-RevDE-HA、pcDNA-RevMiyazaki-HA、pcDNA-RevDevon-HA、pcDNARevPA-HA）共转染HEK293T 细胞，通过western blot检测Gag 的表达情况，评价建立的检测系统对不同EIAV 毒株Rev 的核输出活性的可行性。

2 结果与讨论

2.1 EIAV Gag-Pol 表达载体的构建与鉴定结果构建的pGagpol-RRE 真核表达载体经XhoI 和NotI 双酶切鉴定，结果显示得到的片段约10 000 bp 和570 bp，与预期相符（图1）；进一步测序结果显示目的基因与pLGFD3-8 相应基因序列完全一致，且读码框正确。表明重组质粒pGagpol-RRE正确构建。

图1 重组质粒pGagpol-RRE的酶切鉴定结果Fig.1 Digestion analysis of of identification of recombinant plasmid pGagpol-RRE digestion

2.2 Rev 介导Gag-Pol 表达的检测慢病毒的主要结构蛋白Gag-pol 的表达依赖于Rev 的核输出活性[7]。EIAV Gag 前体蛋白p55 在病毒pol基因编码的蛋白酶作用下被切割成p15、p26、p11 和p9[8]。将重组质粒pGagpol 和pGagpol-RRE 分别与Rev 表达质粒pcDNA-RevFDDV-HA 共转染HEK293T 细胞。36 h 后进行western blot 检测，结果显示，pGagpol无论有无Rev均不表达，pGagpol-RRE 仅在Rev 存在的条件下表达（图2A），而且随着Rev 剂量的增加（0.05 μg、0.1 μg、0.2 μg），Gag55的表达量逐渐增加（图2B），表明Rev通过RRE 介导Gag-Pol 的表达。有研究显示，Rev L36A的突变会破坏其核输出活性[9]。为了验证pGagpol-RRE的表达特异性地依赖于Rev的核输出活性，在pcDNARevFDDV-HA 的基础上，本研究团队前期通过PCR 方法将36 位的L 突变成A，构建Rev 表达载体pcDNARevL36A-HA。将pGagpol-RRE 分别与pcDNA-RevFDDVHA或pcDNA-RevL36A-HA共转染HEK293T细胞，western blot 检测显示，Rev L36A 不能介导Gag-Pol 的表达（图2C），表明Rev介导pGagpol-RRE 的表达依赖于其核输出活性，进一步证明pGagpol-RRE 可用于评价Rev 核输出活性的研究，为研究Rev 的生物学活性奠定了基础。

图2 Rev介导Gag-Pol表达的western blot鉴定结果Fig.2 Western blot analyisis for that the expression of Gag-Pol mediated by Rev

2.3 不同EIAV 病毒株Rev 核输出活性的检测结果对不同EIAV 病毒的Rev 氨基酸序列比对发现，尽管各毒株之间氨基酸序列差异较大，但是对Rev核输出活性有重要影响的关键位点高度保守（aa36、aa45、aa49、aa76、aa77、aa95、aa109）[10]（图3A）。将不同病毒的Rev 表达质粒与pGagpol-RRE 共转染HEK293T 细胞，结果显示：除对照组pGagpol-RRE与pcDNA-HA 共转染检测不到Gag55的表达，其余各病毒株的Rev 均能有效地介导Gag55的表达（图3B）。实验结果提示不同毒株Rev 氨基酸序列的保守区可能对其核输出活性是至关重要的，同时也表明pGagpol-RRE 可用于评价EIAV 不同毒株的Rev 核输出活性，为深入研究Rev 基因变异对其生物学功能的影响提供了重要的方法。

图3 EIAV不同病毒株Rev的核输出活性比较Fig.3 Comparison analysis of nuclear export activities of Rev from different EIAV strains

研究表明，EIAV Rev 是病毒复制必须的附属蛋白，其不仅介导未完全剪切的病毒mRNA 的核输出活性，还可以增强病毒mRNA 的稳定性、促进mRNA 的集聚、调节mRNA 的选择性剪切[11]。最近的研究显示，EIAV 的Rev 还可以拮抗宿主限制因子SAMHD1 促进病毒复制[9]。在EIAV 和HIV-1 感染过程中，rev基因的变异与疾病发展密切相关[12-15]。其中一个重要的原因是Rev 的变异通过减弱其核输出活性，减少Gag 的表达水平，即Rev 可以改变病毒的复制并影响感染者的疾病临床转归。本研究利用Rev 与RRE 的结合介导Gag-Pol 表达的原理，构建了pGagpol-RRE 真核表达载体，将其与Rev 表达载体共转293T 细胞，通过western blot 比较Gag 表达量的变化可分析Rev 的核输出活性。该系统可用来评价EIAV 同源和异源毒株Rev 的核输出活性，为进一步研究EIAV 致病机制奠定了基础。