刘莹莹，阳刘康，卢 伟，张远洋，刘 伟△

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000； 2.湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000）

卵巢癌疾病早期缺乏有效的生物诊断标志，导致超过70%的患者确诊时已为晚期，5 年生存率低于30%［1-2］。桔皮素是一种提取于川橘果皮和柑橘茎叶等的黄酮类化合物，具有抗菌、抑制恶性肿瘤细胞和嗜碱性细胞组胺释放等作用［3］，可有效抑制结肠癌和乳腺癌细胞体外的增殖［4］。Ras/ 丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK）/ 细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路在癌症中常被解除调控，对于癌症的发生起关键作用［5］。约15%的癌症中存在突变的Ras 致癌形式，约30%的癌症中ERK 过度激活对于Ras/ MEK/ ERK 信号通路的解除起调节作用［6］。此外，在黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌中均发现Ras/MEK/ERK 信号通路的异常表达［7］。尽管MEK 本身的激活突变在人类癌症中尚未被发现，其在ERK 通路中的中心作用被认为是治疗人类癌症的重要靶点［8］。本研究中探讨了桔皮素对卵巢癌细胞的体外作用及其对Ras/MEK/ERK 信号通路的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：BSC - 1100ⅡB2 - X 型生物安全柜、BKQ -B75 型高压蒸汽灭菌锅、BJPX - 300L CO2细胞培养箱（中国博科公司）；5320R 型离心机（德国徕卡公司）；伯乐Mini - PRO TEAN 型电泳仪（美国伯乐公司）；EVOS M7000 型倒置显微镜（意大利赛默飞公司）；LAS 4000型成像系统、Bio - Rad 型微孔板阅读器（美国GE Healthcare 公司）；BD FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；VCX 500 型超声细胞破碎仪（中国苑胜公司）。

试药：桔皮素（中国食品药品检定研究院，批号为849542）；阿霉素（南京建成生物有限公司，批号为621548）；RPMI 1640 培养基（批号为2154849），胎牛血清（批号为5549154），胰蛋白酶（批号为8444124），均购自美国Gibco 公司；细胞计数试剂盒8（CCK-8，上海优宁维生物有限公司，批号为2011252）；V-荧光素异硫氰酸酯（FITC）凋亡试剂盒（美国Sun-Shine公司，批号为2011594）；Ras 蛋白抗体（批号为20205949），MEK 蛋白抗体（批号为20206423），ERK 蛋白抗体（批号为20205571），β-actin 蛋白抗体（批号为20178849），均购自美国Abcam 公司；山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物有限公司，批号为59487145）。

细胞：卵巢癌SKOV3细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 方法

细胞培养：从液氮罐中取卵巢癌SKOV3 细胞株冻存管1 支进行细胞复苏，将复苏后的细胞置RPMI 1640培养基中，采用细胞培养皿进行分装，并放置在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h 后更换培养基，当细胞覆盖率达到70%时，在培养皿中加入胰蛋白酶进行细胞传代。在指定时间内，用不同质量浓度（2，5，10µmoL/L）的桔皮素和75 nmol/L阿霉素处理细胞［9］。

细胞分组：将细胞分为空白对照组（A组，0µmol/L），阳性对照组（B组，阿霉素75 nmol/L），桔皮素低、中、高剂量组（分别为C1组、C2组、C3组，桔皮素2，5，10µmol/L）。

细胞处理：取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞，在培养皿中加入1 mL 胰蛋白酶，轻微吹打2 min，使细胞完全悬浮。将悬浮的细胞转移至1.5 mL 离心管中，离心（转速为2 000 r/min）10 min，弃去上清液；加入1 mL RPMI 1640 培养基，并轻微吹打细胞，使细胞充分悬浮，将细胞悬液转移至96孔板中，每孔100µL，在培养箱中培养24 h，弃去96 孔板中的培养基；每孔中依次加入新的RPMI 1640 培养基。按细胞分组项下方法加入药物，每组6个复孔，培养24 h，弃去培养液。

CCK-8 法检测细胞存活率：取细胞处理项下的各组细胞，每孔加入100 µL 培养液和10 µL CCK - 8 溶液，持续培养3 h，使用Bio - Rad 型微孔板阅读器读取450 nm波长处的吸光度，重复3次，并计算细胞存活率。

改良Matrigel Boyden 室测定法测定细胞侵袭性：取细胞处理项下的各组细胞，将细胞接种至有基质胶的滤膜上，滤膜下室仓中放入10%胎牛血清，作为趋化剂，放入培养箱中培养24 h，取出滤膜，染色，使用EVOS M7000 型倒置显微镜对滤膜上的细胞进行计数。每个滤膜随机选择5个视野，重复3次，取平均值。

流式细胞仪检测细胞凋亡率：取细胞处理项下的各组细胞，使用FITC凋亡试剂盒，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2 次，用1X 结合缓冲液在1×106个细胞/mL 浓度下悬浮于400µL V-FITC溶液中，黑暗中室温孵育15 min，加入PI 10 µL，4 ℃避光孵育5 min，立即用BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪分析细胞，重复3次。

蛋白免疫印迹法检测细胞Ras，MEK，ERK 蛋白表达水平：取细胞处理项下的各组细胞，取出培养皿，放入无菌操作台，弃去培养皿中的培养液，并加入1 mL 磷酸盐缓冲液和100µL 蛋白酶K 溶液，使细胞悬浮，采用VCX 500 型超声细胞破碎仪作用2 min 破碎细胞，采用5320R 型离心机离心（转速为3 000 r/min），4 ℃下处理20 min，取上清液，置1 支新的1.5 mL EP 管中。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳分离、转膜、封闭，用特异性抗体Ras，MEK，ERK，β-actin于4 ℃下孵育12 h，用1%吐温清洗孵育后的条带3 次，二抗孵育2 h，经LAS 4000 型成像系统成像，并观察结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计学软件分析。计量资料以±s表示，行单因素方差分析，并采用LSD-t检验行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率、侵袭细胞数和凋亡率

与A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组卵巢癌SKOV3的细胞存活率均显著降低，细胞凋亡率均显著升高，侵袭细胞数均显著减少，且C1组、C2组、C3组效应呈剂量依赖性（P＜0.05）；但C3组和B 组上述指标比较均无显著差异（P＞0.05）。详见表1、图1和图2。

图2 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞凋亡率的影响Fig.2 Effect of tangeretin on apoptosis rate of ovarian cancer SKOV3 cells

表1 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞存活率、凋亡率、侵袭细胞数的影响（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表1 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞存活率、凋亡率、侵袭细胞数的影响（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

注：与A组比较，aP ＜0.05；与C1组比较，bP ＜0.05；与C2组比较，cP ＜0.05；与B组比较，dP ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in group A，aP ＜0.05（for Tab.1-2）；Compared with those in group C1，bP ＜ 0.05（for Tab.1 - 2）；Compared with those in group C2（for Tab.1 - 2），cP ＜ 0.05；Compared with those in group B，dP ＜0.05（for Tab.1-2）.

组别A组B组C1组C2组C3组药物浓度0 75 nmol/L 2µmol/L 5µmol/L 10µmol/L细胞存活率（%）98.11±8.55 31.17±6.29abc 78.22±8.62ad 55.35±8.53abd 31.26±6.74abc细胞凋亡率（%）14.83±4.37 61.84±5.89abc 24.59±4.28ad 41.28±4.77abd 61.71±5.36abc侵袭细胞数（个）169.57±13.55 71.53±11.53abc 131.55±12.78ad 102.87±12.89abd 72.45±11.77abc

2.2 Ras，MEK，ERK 蛋白表达水平

与A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组卵巢癌SKOV3细胞Ras，MEK，ERK 蛋白表达水平均显著降低，且C1组、C2组、C3组效应呈剂量依赖性（P＜0.05）；C3组和B组上述指标比较均无显著差异（P＞0.05）。详见表2和图3。

图3 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞Ras，MEK，ERK蛋白表达的影响Fig.3 Effect of tangeretin on the expression of Ras，MEK and ERK protein in ovarian cancer SKOV3 cells

表2 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞Ras，MEK，ERK蛋白表达水平的影响（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表2 桔皮素对卵巢癌SKOV3细胞Ras，MEK，ERK蛋白表达水平的影响（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

组别A组B组C1组C2组C3组药物浓度0 75 nmol/L 2µmol/L 5µmol/L 10µmol/L Ras/β-actin 0.92±0.08 0.17±0.04 abc 0.69±0.07ad 0.32±0.05abd 0.21±0.05abc MEK /β-actin 0.81±0.07 0.15±0.04 abc 0.57±0.06ad 0.35±0.05abd 0.17±0.04abc ERK/β-actin 0.94±0.09 0.27±0.05abc 0.82±0.09ad 0.59±0.08abd 0.38±0.05abc

3 讨论

卵巢癌的发病率在女性恶性肿瘤中仅次于宫颈癌和子宫体癌，卵巢上皮癌是死亡率最高的妇科肿瘤［10］。由于卵巢体积小且位于盆腔内，卵巢癌早期无明显临床症状，易错过最佳治疗时间，导致癌细胞扩散至盆腔内的脏器时，疾病已发展至晚期，增加了临床治疗的难度［11］。桔皮素具有抑制癌细胞增殖、黏附、转移、凋亡等潜在的抗癌作用［12］，可通过降低过氧化应激引起的前列腺癌细胞中相关氧化应激因子的表达水平来抑制细胞的侵袭和逆转。此外，桔皮素还可减弱乳腺癌、肝癌和肺癌细胞的生存能力，并诱导其凋亡［13］。本研究中检测了不同浓度的桔皮素对卵巢癌SKOV3 细胞的影响，由表1 可知，桔皮素可促进卵巢癌SKOV3 细胞的凋亡，抑制其增殖，减弱其侵袭能力，且呈剂量依赖性，表明桔皮素可有效减慢卵巢癌SKOV3 细胞的增殖速度，通过抑制其侵袭能力而阻止肿瘤细胞扩散，同时通过增加其细胞凋亡率而延缓疾病进程。

Ras/MEK/ERK 信号通路与机体氧化应激密切相关，其异常高表达在多种癌症的转移过程中起关键作用［14］。ERK 是机体中维持细胞氧化还原平衡的关键翻译因子［15］，其表达的增加可诱导下游基因Ras 和MEK的表达，使细胞内氧化应激因子羟自由基水平升高，进一步加重机体氧化应激，导致肿瘤细胞增殖和迁移的活性增加，加重病情［16］。由表2 可知，未对卵巢癌SKOV3细胞进行任何处理时，Ras，MEK，ERK 蛋白均呈高表达；给予桔皮素干预后，Ras，MEK，ERK 的蛋白表达均下调，且具有明显的剂量依赖性。可见桔皮素可能通过调节Ras/MEK/ERK 信号通路来降低细胞内氧化应激，下调细胞氧化应激因子的表达，从而抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖和侵袭，并促进其凋亡。

综上所述，桔皮素可有效抑制卵巢癌SKOV3 细胞的增殖与侵袭，并促进其凋亡，效果与桔皮素的剂量密切相关，作用机制可能与抑制Ras/MEK/ERK 信号通路的蛋白表达有关，但具体作用机制有待深入探究。