汪汉成 向立刚 郑苹 蔡刘体 余知和

摘 要：  为了解青枯病与黑胫病混发烟株茎秆组织的微生物菌群组成，该文采用Illumina Miseq高通量测序技术研究了青枯病与黑胫病混发烟株发病茎秆和健康烟株未发病茎秆组织的真菌、细菌群落结构与多样性。结果表明：（1）发病茎秆组织中真菌群落丰富度与多样性较健康茎秆组织低，细菌群落丰富度与多样性较健康茎秆组织高。（2）健康茎秆组织中的优势真菌属为隐球菌属（Cryptococcus）、链格孢属（Alternaria）和镰刀菌属（Fusarium），三者相对丰度之和>80%。（3）发病茎秆组织中的优势真菌属为隐球菌属、链格孢属、镰刀菌属和unclassified_f_Davidiellaceae。（4）norank_c_Cyanobacteria和劳尔氏菌属（Ralstonia）为发病茎秆组织的优势细菌属。综上所述，青枯病与黑胫病混发能够显著改变烟株茎秆真菌、细菌群落结构与多样性，破坏其微生物群落的稳定。

关键词： 青枯病， 黑胫病， 微生物多样性， Illumina Miseq高通量测序

中图分类号：  Q945.8

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2022）02-0228-12

Microbial community structure and diversity of tobacco

stem tissue in the mixture occurences of

bacterial wilt and black shank

WANG Hancheng1*， XIANG Ligang1，2， ZHENG Ping1， CAI Liuti1， YU Zhihe2

（ 1. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China; 2. College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China ）

Abstract：  In order to understand the composition of microbial flora in the stem tissue of tobacco plants mixed occurrence of bacterial wilt and black shank disease. Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to study the structures and diversities of fungal and bacterial communities in diseased and healthy tobacco stems. The results were as follows： （1） The richness and diversity of the fungal community in the diseased stem tissue were lower than those in the healthy stem tissue， and the richness and diversity of the bacterial community in the diseased stem tissue were higher than those in the healthy stem tissue. （2） Cryptococcus， Alternaria and Fusarium were the dominant fungi in the healthy stem tissue， and the sum of the relative abundances of the three genera were more than 80% of the fungal community. （3） Cryptococcus， Alternaria， Fusarium and unclassified_f_Davidiellaceae were the dominant fungi in the diseased stem tissues. （4） norank_c_Cyanobacteria and Ralstonia were the dominant bacteria in diseased stem tissues. The above results indicate that the mixture of bacterial wilt and black shank disease can significantly change the structures and diversities of fungal and bacterial communities， and can also destroy the stability of microbial community in tobacco stem tissue.

Key words： bacterial wilt， black shank， microbial diversity， Illumina Miseq high-throughput sequencing

煙草是我国重要的经济作物，常年植烟面积达100万hm2，烟草为我国农民增收和国家税收增长做出了很大的贡献（李石力，2017）。烟草根茎性病害是烟草生产上面临的主要难题，目前已有报道的烟草根茎性病害有烟草青枯病、黑胫病、根黑腐病、立枯病、猝倒病、低头黑病和空茎病等（柳德普和戴永平，2015）。其中，以烟草青枯病和黑胫病危害最为突出，其发生面积广，防治难度大，每年因这两种病害造成的经济损失高达数千万元。

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的典型土传维管束病害（霍沁建等，2007），能够侵染包括烟草在内的50多个科的450余种植物（Wicker et al.， 2007）。茄科劳尔氏菌共分为5个生理小种，同时又分为5个生化型或生化变种（谭志琼等，2006;Kumar et al.，2014），我国报道的致病型茄科劳尔氏菌绝大多数为1型生理小种（黄福新等，1998;周泽科等，2013）。烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起（汪汉成等，2011），能够对各个生育期的烟株造成危害，且在团棵期和开花现蕾期最为严重（王海波等，2018）。与茄科劳尔氏菌一样，寄生疫霉烟草变种也存在多个生理小种，全世界已发现的寄生疫霉烟草变种共有4个生理小种（战徊旭等，2015;Gallup et al.，2018），烟草上常见的为0号、1号生理小种（李斌等，2012;张超群等，2016）。因为自然条件下烟草青枯病与烟草黑胫病的发病条件极其相似，所以烟草青枯病与黑胫病常常出现混发的情况（刘烈花，2018;王新等，2018）。

随着高通量测序技术的快速发展与普及，越来越多的人将其应用于烟草微生态领域的研究，但大都侧重于根际土壤微生物（施河丽等，2018;张笑宇等，2019）以及烟株内生菌（林丽等，2017;李盼盼等，2018）的研究，鲜有关于烟株茎秆组织微生态研究的报道。而根际土壤中诸如青枯菌等病原菌和其他微生物均可以通过维管束等转移至烟株茎、叶等部位，造成烟株地上部分尤其是茎秆微生物群落的变化，甚至失衡，因此，对于发病烟株茎秆微生物群落变化的研究十分必要。为了解烟株感染根茎性病害前后茎秆中微生物群落的变化，本实验室先后对感染青枯病烟株茎秆真菌、细菌群落结构（向立刚等，2019a），以及感染黑胫病烟株茎秆真菌、细菌群落结构（向立刚等，2019b）进行了研究，掌握了烟株感染青枯病、黑胫病后茎秆中优势真菌、细菌群落的组成情况。但尚不清楚青枯病与黑胫病混发对烟株发病茎秆组织中真、细菌群落的影响，因此，本文选取青枯病与黑胫病混发烟株茎秆和健康烟株茎秆，运用Illumina高通量测序技术研究同时感染青枯病和黑胫病烟株茎秆组织中真、细菌群落结构与多样性变化，以期揭示青枯病与黑胫病混发烟株茎秆组织的微生物菌群组成。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年8月于贵州省福泉市烟草科学研究院种植‘云烟87’品种的试验田（107°30′41″ E，26°44′48″ N），随机选取3株出现明显青枯病与黑胫病混发病症的成熟期烟株，用经高温灭菌的剪刀剪取发病烟株发病茎秆组织5 cm长的样品，即为发病茎秆组（BJ），样品分别编号为AHBJ、BHBJ和CHBJ;在相同田块，随机选取肉眼观察无明显病症且长势良好的3株健壮烟株作为健康茎秆组（J）样品，取与发病株等高的烟株茎秆组织样品，样品编号为AHJ、BHJ和CHJ。采集的组织样品立即装入无菌取样袋中，低温保藏带回实验室置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 DNA提取及目标片段PCR扩增

取冻存的茎秆组织样品，先用剪刀将其剪成小段，随后放入研钵中加入适量的液氮充分研磨成粉末状。称取50 mg组织粉末样品，采用植物组织DNA提取试剂盒（Qiagen， 69104）提取DNA，具体操作步骤按其操作说明进行。以提取DNA为模板，分别对真菌转录间隔区的ITS1区域，细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增。ITS区扩增引物为ITS1F （5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R （5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）（White et al.， 1990），细菌16S rRNA基因扩增引物为338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR扩增体系和反应程序参数参照陈乾丽等（2019）的方法进行。最后将满足建库要求的产物纯化后送至上海美吉生物医药科技有限公司进行Miseq文库构建和Miseq PE300平台（Illumina公司）高通量测序。

1.3 生物信息学分析

使用Trimmomatic软件（Bolger et al.， 2014）优化原始数据，首先根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，然后去除50 bp以下的序列以及含N碱基的序列，去掉引物错配数大于2的序列，最后过滤掉双端reads之间的overlap区长度小于10 bp以及错配率大于0.2的序列。优化后的序列用FLASH软件（Caporaso et al.， 2011）进行序列拼接。用UPARSE软件（Edgar， 2013）对97%相似度序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类。利用RDP classifier（Wang et al.， 2007）比对Unite数据库（http：//unite.ut.ee/index.php），对每条ITS序列进行物种分类注釋，比对Silva（http：//www.arb-silva.de）数据库，对每条16S序列进行物种分类注释。聚类后的OTU用于物种组成及差异分析、Venn图绘制、Alpha多样性分析（Sobs指数、Ace指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数以及Coverage指数）等。本实验所有生物信息学分析均在上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger生信云网站平台（http：//www.i-sanger.com/project/index.html）操作完成。

2 结果与分析

2.1 数据质控

本次实验样品真菌测序共获得234 080条高质量序列，最大序列长度356 bp，最小序列长度201 bp，平均序列长度257 bp，其中发病茎秆组获得序列116 717条，健康茎秆组获得117 363条;细菌测序共获得217 446条高质量序列，最大序列长度479 bp，最小序列长度254 bp，平均序列长度431 bp，发病茎秆组获得108 023条，健康茎秆组获得109 423条。其余单个样品详细质控信息见表1。

2.2 OTU聚类分析

如表2所示，发病茎秆组真菌菌落种类较健康茎秆组略有降低，其中门、纲、目、科、属、种和OTU数分别减少2、3、5、11、14、17、31个;发病茎秆组的细菌菌落较健康茎秆组增加，门、纲、目、科、属、种和OTU数量分别增加4、6、17、27、61、82、93个。因此，烟草青枯病和黑胫病混发降低了烟株茎秆真菌群落的物种多样性，增加了茎秆中细菌群落的多样性。

2.3 群落多样性、基本结构及组成分析

各样品的Alpha多样性指数如表3所示，Ace指数、Chao1指数和Sobs指数用于表示群落丰富度，其数值越大表示群落丰富度越高;Shannon指数和Simpson指数表示群落多样性，Shannon指数值越大或Simpson指数值越小表示群落多样性越高。样品的真菌群落表现为健康茎秆组真菌群落丰富度与多样性均高于发病茎秆组，但不存在显著性差异。健康茎秆组细菌群落丰富度与多样性低于发病茎秆组，不存在顯著性差异。本次所有测序样品的Coverage指数均大于0.99，表明测序结果能够较为真实地反映茎秆中实际的菌群组成情况。

图1为样品中真菌属和细菌属的相对丰度条形图，相对丰度低于0.1%的菌属归入其他（Others）。因为样本CHBJ与其余两发病烟株样本微生物组成存在明显差异，所以群落分析时不将此样本数据作为参考。由于数据库的限制，相对丰度条形图中还存在部分未鉴定出来的菌属，其以unclassified_和norank_开头。健康茎秆样品中优势真菌属为隐球菌属（Cryptococcus）、链格孢属（Alternaria）和镰刀菌属（Fusarium），三者的相对丰度之和大于80%;发病茎秆各样品的优势真

Venn图（图2）结果显示发病茎秆组与健康茎秆组样品共有的真菌属有50个，其中：隐球菌属、链格孢属、镰刀菌属、unclassified_k_Fungi、unclassified_f_Davidiellaceae为主要菌属，所占百分比分别为29.01%、28.58%、17.06%、11.95%、10.21%，其余菌属占比小于1%;发病茎秆组样品中独有的属有10个，分别为unclassified_f_norank_o_Sporidiobolales占比45.83%，Myrmecridium、绿僵菌属（Metarhizium）、unclassified_f_Psathyrellaceae和枝孢霉属（Cladosporium）占比均为8.33%，瓶霉菌属（Phialophora）、unclassified_c_Exobasidiomycetes、unclassified_o_Trechisporales、篮状菌属（Talaromyces）和外瓶霉菌属（Exophiala）占比均为4.17%;健康茎秆组样品中独有的属有24个，物种数占总数百分比大于1%的属分别为被孢霉属（Mortierella）42.97%，刺盘孢属（Colletotrichum）18.75%，unclassified_c_norank_p_Zygomycota 11.72%，unclassified_f_norank 5.47%，帚枝霉属（Sarocladium）2.34%，unclassified_f_Chaetomiaceae、unclassified_f_norank_o_Trichosphaeriales、unclassified_o_Helotiales、Lophiostoma和Auriculibuller占比均为1.56%。

发病茎秆组与健康茎秆组样品共有的细菌属有61个，物种数占比大于1%的属有norank_c_Cyanobacteria 72.34%，劳尔氏菌属19.03%和norank_f_Mitochondria 5.84%;发病茎秆组中独有的细菌属有79个，物种数占比大于1%的属有拟杆菌属（Bacteroides）33.08%，Paenochrobactrum 8.40%，unclassified_f_Alcaligenaceae 6.62%，拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）7.38%，粪产碱菌属（Alcaligenes）4.07%，塔特姆菌属（Tatumella）3.56%，Incertae_Sedis_f_Lachnospiraceae 2.80%，链霉菌属（Streptomyces）2.29%，假丁酸弧菌属（Pseudobutyrivibrio）2.04%，萨特氏菌属（Sutterella）1.78%，假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、甲基杆菌属（Methylobacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、食酸菌属（Acidovorax）和分枝杆菌属（Mycobacterium）占比均为1.02%;健康茎秆组中独有的属为18个，Allobaculum和Lachnoclostridium物种数占比均为12.50%，Akkermansi和不动杆菌属（Acinetobacter）占比均为8.33%， 瘤胃球菌属2

（Ruminococcus_2）、Rheinheimera、Clostridium_sensu_stricto_1、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、Sulfuritalea、norank_f_FFCH7168、Niabella、土壤芽胞杆菌属（Solibacillus）、Pelomonas、Variibacter、Citricoccus、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、Byssovorax和拟普雷沃菌属（Alloprevotella）14个菌属占比均为4.17%。

图3为茎秆样品中相对丰度为前30的真菌、细菌菌群热图，热图上方与左边分别为样品层级聚类树和物种层级聚类树，两聚类树的聚类方式均为Average。真菌菌群中6个样品共聚为两大类，AHBJ、BHBJ、CHJ、AHJ和BHJ聚为一类，CHBJ单独聚为一类，表明CHBJ样品与其余2个发病烟株茎秆样品间样本距离差异较大，健康烟株茎秆样品间样本距离较小;细菌菌群中CHBJ与CHJ两样品聚为一类，其余4样品聚为一类，因此，细菌菌群中健康茎秆组与发病茎秆组组内样本距离均存在较大差异。

2.4 Beta多样性分析

通过主成分（PCA）分析健康与发病烟株茎秆中真菌、细菌在属水平组成上的差异。如图4：a所示，导致发病与健康烟株茎秆真菌群落产生差异的主要因素PC1和PC2分别占全部影响因素的67.36%和26.67%。其中：健康烟株3个茎秆样品真菌群落组成相似，样本距离较近;发病烟株3个茎秆样品真菌群落组成差异较大，样本距离较远;发病烟株BHBJ茎秆样品与健康烟株茎秆样品样本距离较近，真菌群落组成差异较小。由图4：b可知，导致发病与健康烟株茎秆样品细菌群产生差异的主要因素PC1和PC2分别占全部影响因素的51.66%和17.49%。在PC1的作用下健康烟株茎秆样品与发病茎秆CHBJ和BHBJ样品间细菌群落组成差异较小，AHBJ样品与其余5个样品间差异较大。整体而言，烟株感染青枯病与黑胫病对茎秆真菌群落结构的影响较大，而对细菌群落结构的影响较小。

LEfSe多级物种差异分析可用于寻找不同分组中具有统计学差异的生物标记菌群。由图5：A可知，当LDA阈值为4时，健康烟株茎秆样品中担子菌门Basidiomycota、Tremellomycetes纲、Tremellales目、norank_o_Tremellales科、Bulleromyces属和隐球菌属与发病茎秆样品存在显著性差异。如图5：B所示，发病茎秆与健康茎秆中细菌群落不存在具有统计学差异的生物标记菌群。

3 讨论与结论

微生物群落的Alpha多样性指数用于反映微生物群落结构的复杂程度。一般而言，微生物群落结构越复杂，微生态环境越稳定，群落的多样性指数也就越高（贺纪正等，2013）。本研究中，发病茎秆样品较健康茎秆真菌群落种类降低，细菌群落种类增加;发病茎秆组样品真菌群落丰富度与多样性低于健康茎秆样品，细菌群落丰富度与多样性高于健康茎秆样品。说明健康烟株茎秆中真菌群落结构优于青枯病和黑胫病混发烟株茎秆，发病烟株茎秆细菌群落结构优于健康烟株茎秆。

健康烟株茎秆中隐球菌属、链格孢属和镰刀菌属为绝对优势菌属，而在发病烟株茎秆中不同样品中真菌组成存在较大差异;除以上3种菌属外，unclassified_f_Davidiellaceae也為部分发病烟株茎秆中的优势菌属。隐球菌属多为人类疾病病原菌，关于隐球菌导致的植物病害鲜有报道。链格孢属在不同生境中广泛存在，多数链格孢菌能够引起多种植物病害（黄伟等，2016;刘迪等，2018），

而某些链格孢菌由于具备高产纤维素酶的能力而具备开发成生防制剂的潜力。镰刀菌属由于种的差异，部分镰刀菌可产生激素，促进植株的生长发育，有的可降解纤维素和有机物，而另一部分则可侵染多种植株致使植株萎蔫和根部腐烂（张向民，2005）。细菌群落中norank_c_Cyanobacteria为绝对优势菌，但目前没有关于蓝细菌作为植物内生细菌的报道，其主要分布于淡水、海水和土壤中（李佳霖等，2015）。此次实验在烟株茎秆中检测出了蓝细菌，可能是烟株叶绿体DNA造成的污染，而norank_f_Mitochondria则可能是烟株细胞线粒体DNA造成的污染。此推断有待在今后的研究中进一步验证。所有茎秆中均检测到了劳尔氏菌属，但为何健康烟株未表现出明显的发病迹象，可能与劳尔氏菌属中存在不同的生理小种有关，不同的生理小种致病力不同，有的生理小种致病力强，而有的却无致病力（邹阳等，2013）。有研究报道无致病力的茄科劳尔氏菌可诱导植株产生免疫能力，从而达到抵抗青枯病的效果（陈庆河，2001）。而作为黑胫病病原菌的寄生疫霉烟草变种因为其已划分为卵菌，不再归属于真菌，所以Unite数据库中没有相应的序列信息，因此，本次测序结果中未见Phytophthora属菌群。在本实验室前期研究结果中感染青枯病烟株茎秆组织中主要细菌属为劳尔氏菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Gemmatimonas）和肠杆菌属（Enterobacter），主要真菌包括小画线壳属（Monographella）、隐球菌属、镰刀菌属和Coprinopsis;感染黑胫病烟株茎秆组织中主要细菌属为norank_c_Cyanobacteria，主要真菌属为隐球菌属、链格孢属、镰刀菌属和红酵母属（向立刚等，2019a，b）。相较于青枯病和黑胫病单独发病的茎秆组织，混合的发病茎秆组织中小画线壳属、Coprinopsis和红酵母属真菌，假单胞菌属和芽孢杆菌属细菌降为非优势菌属。因此，青枯病、黑胫病混发对于烟株茎秆微生物群落的影响有别于两种病害单独发生造成影响的叠加。

发病烟株茎秆较健康烟株茎秆中独有的真菌属有10个，除去未鉴定到属的真菌，还有Myrmecridium、绿僵菌属、枝孢霉属、瓶霉菌属、篮状菌属和外瓶霉菌属。绿僵菌属是广谱的昆虫病原真菌（陈名君等，2018），对植物是否存在致病作用目前尚无报道。枝孢霉属为常见的腐生真菌，部分枝孢霉属真菌为植物上的病原菌，侵染植株叶片、枝条和果实（吕靖雯等，2018），从病株茎秆中检测到该菌属，可能是茎秆感病腐烂后环境中的枝孢霉菌定殖的结果，进而加重烟株茎秆的腐烂程度。瓶霉菌属等真菌在发病烟株茎秆中可能的作用尚不明确。发病茎秆中独有的细菌属为79个，其中，拟杆菌属和粪产碱菌属主要为人类临床上常见病菌，能够寄居于人体呼吸道和肠道等部位，对烟草无致病报道。拟诺卡氏菌属是一个经典的丝状放线菌类群，能够合成酶抑制剂和抗生素等多种活性物质（李文均等，2016），对植物无致病潜力。链霉菌属多数为腐生好气性异养菌，大部分链霉菌为非致病的污染菌或定殖菌。假丁酸弧菌属、假黄色单胞菌属和类芽孢杆菌属等发病茎秆中独有的菌属均没有使植物致病的报道。

青枯病与黑胫病混发能够明显导致烟株茎秆真菌、细菌群落结构与多样性的改变，破坏了烟株茎秆中微生物群落的稳定。发病后烟株茎秆中真菌群落丰富度与多样性降低，细菌群落丰富度与多样性增加，部分腐生真菌、细菌也广泛定殖于烟株茎秆上。研究结果增加了我们对青枯病与黑胫病混发烟株茎杆组织微生态的认识，但烟草青枯病菌先侵染、黑胫病菌后侵染，烟草黑胫病先侵染、青枯病菌后侵染，以及2种病原菌同时复合侵染引起的烟株病害微生态规律的研究仍有待下一步继续探索。

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（责任编辑 周翠鸣）

收稿日期：  2020-12-08

基金项目：  国家自然科学基金（31960550）;中国烟草总公司科技项目（110202101048[LS-08]）;贵州省科技厅优秀青年人才培养计划（黔科合平台人才 [2017]5619）;中国烟草总公司贵州省公司科技项目（201914，2020XM03） [Supported by National Natural Science Foundation of China（31960550）; Science and Technology Project  of China National Tobacco Corporation （110202101048[LS-08]）; Outstanding Young Talent Training Program of Guizhou Provincial Science and Technology Department （QianKehe Platform Talents  [2017] 5619）; Science and Technology Project  of China National Tobacco Corporation Guizhou Provincial Company （201914， 2020XM03）]。

第一作者： 汪汉成（1982-），博士，研究员，主要从事植物保护研究，（E-mail）xiaobaiyang126@hotmail.com。

*通信作者

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