张兆丰，万 勇，余有贵，杨志龙，熊 翔

（1.邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000；2.生态酿酒新技术与应用湖南省高校重点实验室，湖南邵阳 422000；3.湖南湘窖酒业有限公司，湖南邵阳 422000）

浓香型白酒的主要呈味成分是己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯，而占主导地位的是己酸乙酯，但是现在生产的浓香型白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量非常高，为了解决这一问题，许多研究学者提出增己降乙，增己降乳等方法。任雪等所采用的无窖泥生产浓香型白酒，通过添加发酵液所生产的浓香型白酒四大酯含量协调。刘选成等针对此问题通过改进生产工艺来达到降低乙酸乙酯的目的，改进后乙酸乙酯含量降低了32.29 %。代佳慧等对成品浓香型白酒进行微波辐射，在微波辐射时间为20～100 min 时，能对白酒中乙酸及乙酸乙酯的含量产生影响。除此之外，还有采用新窖池生产、使用强化大曲、窖泥的培养以及超级菌种等方法。

以小曲为糖化发酵剂的小曲酒，主要呈味物质是乳酸乙酯。传统浓香型白酒过于浓烈，在白酒淡爽化的新潮中，可通过大小曲联用生产出醇香清雅、酒体柔和、回甜爽口、纯净怡然的新品白酒。本研究以高粱、玉米、大米、糯米为原料，在固态发酵法中使用小曲为糖化发酵剂，通过分析粮醅理化指标，对糖化堆积中的糠壳、小曲、玉米添加量以及糖化堆积时间等参数进行工艺优化，为提高白酒出酒率、开发新型口味特征浓香型白酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：高粱、大米、糯米、玉米、糠壳、小曲，均由湖南湘窖酒业有限公司提供。

试剂及耗材：葡萄糖、琼脂、蛋白胨、可溶性淀粉、酒石酸钾钠、浓盐酸、氢氧化钠、次甲基蓝等：分析纯，市场购买。

仪器设备：恒温培养箱（DH-420型），北京科伟永兴仪器有限公司；恒温水浴锅（DK-99-3 型），江苏金坛中大仪器厂；磁力搅拌器（HJ-1 型），常州越新仪器制造有限公司；自动压力蒸汽灭菌器（GI54DWS 型），致微（厦门）仪器有限公司；便携式pH 计（LE438 型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超净工作台（SW-CJ-1FD 型），苏州智净净化设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

高粱、大米、糯米、玉米→润料→混合蒸粮→摊晾→白曲拌合→糠壳拌合→培菌堆积糖化

1.2.2 操作要点

原料处理：高粱、大米、糯米均为整粒粮食；玉米要求粉碎成能通过2.0 mm筛孔的占3/4。

润料：常温水浸泡1.5～2 h。

摊晾：摊晾均匀，与室温相差1 ℃以内。

白曲拌合：白曲的用量以粮食的重量计，添加量为粮食的0.3%。

糠壳拌合：糠壳的用量以粮食的重量计，添加量为粮食的一定百分比。

培菌堆积糖化：糖化后的粮食要求清香味甜，不流汁，无霉变和异味。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 不同堆积时间对培菌堆积糖化的影响

高粱、大米、糯米、玉米按照指导书的比例混合，小曲添加量为0.3 %，糠壳的添加量为1 %，在糖化过程中，分别测定0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、70 h 的还原糖、酸度、淀粉含量及微生物生长数量确定最佳的培菌时间。

1.2.3.2 不同粮食添加量对培菌堆积糖化的影响

高粱与大米的添加量不做改变，以总量100%为计，改变玉米的添加量5%、7.5%、10%、12.5%、15 %，糯米的添加量15 %、12.5 %、10 %、7.5 %、5%，小曲的添加量为0.3%，糠壳的添加量为1%，培菌糖化时间为24 h，经糖化发酵后，通过测定还原糖、酸度、淀粉含量及微生物生长数量确定最佳的粮食添加量。

1.2.3.3 不同小曲添加量对培菌堆积糖化的影响

高粱、大米、糯米、玉米按照指导书的比例混合，堆积糖化时间为48 h，小曲添加量为0.1 %、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，糠壳的添加量为1%，经糖化发酵后，通过测定还原糖、酸度、淀粉含量及微生物生长数量确定最佳小曲添加量。

1.2.3.4 不同糠壳添加量对培菌堆积糖化的影响

高粱、大米、糯米、玉米按照指导书的比例混合，堆积糖化时间为48 h，小曲添加量为0.3 %，糠壳添加量为1 %、2 %、3 %、4 %、5 %，经糖化发酵后，通过测定还原糖、酸度、淀粉含量及微生物生长数量确定最佳糠壳添加量。

1.2.4 响应面试验

确定不同时间（A）、玉米添加量（B）、小曲添加量（C）、糠壳添加量（D）为响应因素，设计四因素三水平响应面实验，以还原糖含量为响应值，小曲糖化工艺响应试验设计见表1。

表1 响应面设计因素水平表

1.2.5 分析方法

酸度、水分、还原糖、淀粉的测定：参考标准DB 34/T 2264—2014；霉菌、酵母计数：参考国标GB 4789.15—2016。

1.3 数据统计

采用Excel 软件进行数据统计，采用Origin 2018 软件作图，利用Design Expert 12 进行响应面试验设计及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 堆积时间对培菌堆积糖化的影响

不同的堆积时间对糖化醅的指标影响见图1—图4，除淀粉的消耗外，时间在很大程度上对糖化醅的各项指标有着相同的影响，各项指标随着时间的延长都呈现出递增的变化。考虑到企业的可实行性以及入窖的糖化醅标准，酸度低于0.6 mol/L，时间的缩短，故最佳糖化堆积时间选择48 h。

图1 堆积时间对还原糖及淀粉的影响

图2 堆积时间对霉菌及酵母的影响

图3 堆积时间对酸度的影响

图4 堆积时间对水分的影响

2.1.2 粮食添加量对培菌堆积糖化的影响

不同的粮食添加量对糖化醅的指标影响见图5—图7。由图5—图7 可知，随着玉米添加量的改变，还原糖呈现先上升后下降的趋势，淀粉呈现下降趋势，但下降趋势不明显，水分呈现上升的趋势，霉菌在玉米添加量10%时数量最多。分析原因是玉米中的支链淀粉较多，在短时间内难以被微生物利用转化为还原糖，淀粉剩余量较多，还原糖较少的情况下对酵母生长有一定的影响，水分呈现增长的趋势，分析原因是玉米的吸水性较强。故玉米最佳添加量为10%。

图5 玉米添加量对还原糖及淀粉的影响

图6 玉米添加量对霉菌及酵母的影响

图7 玉米添加量对水分的影响

2.1.3 小曲添加量对培菌堆积糖化的影响

不同的小曲添加量对糖化醅的指标影响见图8—图10。由图8—图10 可知，还原糖在小曲添加量为0.3%时最高，淀粉在此添加量下利用较好，霉菌在此条件下数量最高；酵母数量及水分含量随着添加量的增加而升高。故最佳小曲添加量为粮食比重的0.3%。

图8 小曲添加量对还原糖及淀粉的影响

图9 小曲添加量对霉菌及酵母的影响

图10 小曲添加量对水分的影响

2.1.4 糠壳添加量对培菌堆积糖化的影响

不同的糠壳添加量对糖化醅的指标影响见图11—图13。由图11—图13 可知，糠壳4 %时还原糖含量最高，淀粉最低，霉菌生长较好，水分较低，酵母生长情况较好。在糠壳合适的添加量情况下，粮醅的疏松度较好，有利于霉菌产糖的进行，能对粮醅的水分含量产生一定的影响作用，是因为糠壳能对堆积温度有一定的调控作用。故糠壳最佳添加量为4%。

图11 糠壳添加量对还原糖及淀粉的影响

图12 糠壳添加量对霉菌及酵母数量的影响

图13 糠壳添加量对水分的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果分析

在单因素试验的基础上，以还原糖含量为响应值，选取对粮醅有影响的堆积时间、粮食添加量、小曲添加量和糠壳添加量进行4 因素3 水平的响应面分析试验，试验结果见表2。

通过Design Expert 12 共设计29 组试验，对表2的数据进行多元回归拟合，得到二次响应面回归模型为：还原糖含量=20.84-0.2125A+0.0792B+0.4792C-0.1292D-0.25AB+0.2375AC-1.13AD-0.25BC+7875BD+0.275CD-2.53A-1.73B-1.71C-1.04D

表2 响应面试验设计及结果

进一步对该回归模型进行显著性分析，响应面数据的方差分析结果见表3。由表3 可知，该模型回归极显著（P＜0.001），失拟项的p 值0.0645，p＞0.05，表明该模型失拟不显著，说明其他因素对模型的干扰程度较低，试验结果与回归模型拟合度较好。回归方程的可信度分析显示，该模型的R为97.16 %，R=94.31 %，变异系数CV=2.16 %，说明试验的拟合度较好。比较F 值大小可知，影响粮醅中还原糖含量的因素顺序为：小曲添加量（C）＞堆积时间（A）＞糠壳添加量（D）＞玉米添加量（B）。根据试验结果可知，模型中C、AD、BD、A、B、C、D对粮醅的还原糖含量影响极显著。

表3 回归方程方差分析

2.2.2 响应面试验图形分析

图14 为各因素间交互作用的响应面三维曲面图和等高图，图14 能直观反映各实验因素的交互作用情况，响应面越平缓表示该因素对还原糖含量影响越小，响应面越陡峭，说明该因素对还原糖含量影响越显著，图14 中a、c、e、g 都相对陡峭，i、k 相对平缓，图14 中b、d、f、h、j、l 为还原糖含量对应各因素构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，能客观反应各因素之间的交互作用及其对响应值的影响。图14f 为一个椭圆形，表示两因素交互作用显著，即堆积时间和糠壳添加量交互作用明显；图14a 为一个圆形，表示两因素交互作用不显著，即堆积时间和玉米添加量交互作用不明显，与上述结论一致。

图14 各因素间交互作用的响应面及等高线图

2.2.3 最优工艺参数确定及验证

根据响应面试验结果分析可得小曲糖化工艺的最佳参数为：糖化时间为47.62 h，玉米的添加量为10.03%，小曲添加量为0.3135%，糠壳添加量为3.98%。考虑试验的可操作性，将试验参数调整为糖化时间为48 h，玉米的添加量为10%，小曲添加量为0.3%，糠壳添加量为4%，测得还原糖含量为20.9 %，与预测值接近，说明响应面法优化得到的小曲糖化堆积工艺参数是合理的，具有一定的实际指导意义。

3 结论

以单因素试验为基础研究小曲堆积糖化工艺中的粮食添加量、小曲添加量、糠壳添加量及堆积糖化时间对糖化醅中还原糖含量的影响。采用多因素的响应面试验优化糖化工艺。结果表明，最佳糖化堆积工艺为：糠壳添加量为4%、小曲添加量为0.3%、玉米添加量为10%、糖化堆积时间为48 h，在此条件下生产的粮醅还原糖含量为20.9 g/100 g，粮醅蜜香清雅、味甜纯正，结果为后续发酵工艺优化与酿酒效果的研究奠定了基础。