杨芒庄，杨旭东，王晓龙

(黄河三门峡医院 泌尿外科, 河南 三门峡 472000)

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一[1]，主要发生在膀胱黏膜上，占中国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，男性发病率明显高于女性。CircRNA是一类在活体中有时也有表达特殊的非编码RNA分子，在活体中有表达。环状RNA(circular RNA，circRNA)分子富含微小RNA(microRNA，miRNA)结合位点，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用[2]。有研究表明，circRNA和miRNA在膀胱癌细胞中均有表达，影响膀胱癌的发生发展[3]。本实验主要探讨circ-MALAT1靶向miR-101通过PI3K/AKT信号通路影响膀胱癌侵袭和迁移的实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 膀胱癌组织和癌旁组织来源：选取2018年3月至2019年5月在三门峡医院进行手术治疗的膀胱癌患者40例，其中男21例，女19例，年龄45～70岁。术中切除癌组织及癌旁组织，癌旁组织是指距离病灶2 cm的组织。本研究经三门峡医院伦理委员会批准(批准号：201712034)，所有患者签署知情同意书。

1.1.2 细胞与试剂：人膀胱移行细胞癌细胞系SW780(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)；荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)；Transwell小室、Matrigel胶(北京索莱宝生物科技有限公司)；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；一抗、二抗(北京明阳科华生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组：用含10%胎牛血清DMEM培养基培养SW780，在为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，取对数增殖期细胞进行后续实验，将si-NC组(转染si-NC)、si-circ-MALAT1组(转染si-circ-MALAT1)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-101组(转染miR-101 mimics)、(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)组(共转染si-circ-MALAT1和anti-miR-NC)、(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)组(共转染si-circ-MALAT1和anti-miR-101)转染至SW780细胞。

1.2.2 RT-qPCR检测circ-MALAT1和miR-101表达水平：采用Trizol试剂提取各组细胞中的总RNA，使用分光光度计测定RNA的浓度，再用反转录试剂盒将RNA合成cDNA。随后使用SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒进行扩增。Circ-MALAT1以GAPDH为内参，miR-101以U6为内参。采用2-ΔΔCt法计算circ-MALAT1和miR-101相对表达量。

1.2.3 Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移：用稀释的基质胶包被Transwell上腔室膜进行侵袭实验。每组取1×104个细胞接种Transwell上腔室中，加入200 μL无血清培养基。24孔板下室中加入500 μL含10%胎牛血清的细胞培养基作为诱导剂。培养箱孵育24 h，棉签除去基质胶和未过膜细胞。甲醇固定侵袭过膜的细胞，结晶紫染色15 min。显微镜观察细胞，随机选取5个视野计数采用均数表示细胞侵袭数量。迁移实验时采用未包被基质胶的小室，其他步骤与侵袭实验一致。

1.2.4 Western blot检测MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT蛋白表达：收集各组细胞，在放射免疫沉淀缓冲液裂解以提取蛋白，用BCA法定量。吸取蛋白样品(30 μg)进行10% SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上。在5%脱脂牛奶封闭液中封闭膜，室温下孵育1 h。随后，将PVDF膜与抗MMP-2(1∶1 000)、抗MMP-9(1∶1 000)、抗p-PI3K(1∶1 000)和抗p-AKT(1∶1 000)抗体孵育过夜。之后，膜用HRP标记的IgG抗体室温孵育1 h，通过增强化学发光试剂盒对膜进行显影，Image J软件对蛋白条带进行分析。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验检测circ-MALAT1对miR-101的靶向关系：使用LipofectamineTM2000转染试剂将构建好的WT-circ-MALAT1质粒和MUT-circ-MALAT1质粒分别与miR-101 mimics和阴性对照miR-NC共转染至SW780细胞。细胞培养48 h之后，检测相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Circ-MALAT1和miR-101在癌旁组织和膀胱癌组织中的表达

与癌旁组织比较，膀胱癌组织中circ-MALAT1表达水平明显上调(P<0.05)，miR-101表达水平明显下调(P<0.05)(表1)。

表1 Circ-MALAT1和miR-101在癌旁组织和膀胱癌组织中的表达

2.2 抑制circ-MALAT1表达对SW780细胞侵袭和迁移的影响

与si-NC组比较，si-circ-MALAT1组中circ-MALAT1表达水平明显下调(P<0.05)，侵袭、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9蛋白表达明显下调(P<0.05)(图1，表2)。

表2 抑制circ-MALAT1表达对SW780细胞侵袭和迁移的影响

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

2.3 上调miR-101表达对SW780细胞侵袭和迁移的影响

与miR-NC组比较，miR-101组中miR-101表达水平明显上调(P<0.05)，侵袭、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9蛋白表达明显下调(P<0.05)(图2，表3)。

表3 上调miR-101表达对SW780细胞侵袭和迁移的影响

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

2.4 Circ-MALAT1靶向调控miR-101

Starbase数据库预测显示circ-MALAT1与miR-101存在结合位点(图3)。实验显示，转染野生型表达载体WT-circ-MALAT1，与miR-NC组相比，miR-101组中细胞荧光素酶活性明显下调(P<0.05)(表4)。

表4 双荧光素酶报告基因实验

图3 Circ-MALAT1与miR-101的结合位点

2.5 抑制miR-101部分逆转沉默circ-MALAT1对SW780细胞侵袭和迁移的影响

与(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)组比较，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)组细胞侵袭、迁移细胞数以及MMP-2、MMP-9蛋白表达明显上调(P<0.05)。(图4，表5)。

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

表5 抑制miR-101部分逆转沉默circ-MALAT1对SW780细胞侵袭和迁移的影响

2.6 PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

与si-NC组比较，si-PVT1组p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显下调(P<0.05)，与(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)组比较，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)组p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显上调(P<0.05)(图5，表6)。

表6 PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

图5 Western blot检测蛋白表达

3 讨论

膀胱癌在人体内的发生发展严重威胁着机体的健康和安全，临床上的治疗手段主要有化学药物治疗、放射治疗及手术治疗，但是副作用比较大，复发率比较高，患者预后不良。膀胱癌的病理类型有很多，主要包括尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌和膀胱腺癌。该疾病严重威胁人类的生命和健康[4-5]。基因治疗膀胱癌是一种新的治疗方式，主要是通过某些基因突变的靶点进行靶向治疗，治疗效率高，针对肿瘤细胞作用不损伤正常组织。

本实验研究表明，与癌旁组织比较，膀胱癌组织中circ-MALAT1表达明显上调，miR-101表达明显下调。已经有研究表明结果与本实验一致，circ-MALAT1在肝癌细胞中表达水平显著上调[6]；miR-101在膀胱癌细胞中的表达显著下调[7]。

本实验研究发现，与si-NC组比较，抑制circ-MALAT1表达组中circ-MALAT1表达水平明显下调，侵袭、迁移细胞数明显下调。与miR-NC组比较，过表达miR-101后，侵袭、迁移细胞数明显下调。与(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)组比较，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)组细胞侵袭、迁移细胞数明显上调。已有有类似的报道与本实验研究结果一致。Circ-ITCH通过调控miR-17或 miR-224表达来抑制膀胱癌的发展[8]。Circ-BCRC-3通过miR-182-5p或者p27轴抑制膀胱癌的增殖[9]。CircUBXN7通过海靶向miR-1247-3p增强膀胱癌中B4GALT3的表达来抑制细胞增殖和侵袭[10]。下调hsa_circ_0000144通过刺激miR-217和抑制RUNX2表达来抑制膀胱癌的进展[11]。通过靶向miR-223或成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)轴来沉默circ-UVRAG抑制膀胱癌的生长和转移[12]。

P13K/AKT信号传导通路在恶性肿瘤的发生，发展，治疗及转归中发挥着重要作用，对肿瘤细胞的增殖和凋亡起非常重要的调节作用。P13K/AKT信号通路在膀胱癌的发生发展中发挥着极其重要的作用[13-15]。本实验表明，与si-NC组比较，si-PVT1组p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显下调，与(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)组比较，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)组p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显上调。说明干扰circ-MALAT1表达，上调miR-101表达，通过抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移。

综上所述，抑制circ-MALAT1表达并上调miR-101抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移，其机制与PI3K/AKT信号通路有关。研究结果为膀胱癌的治疗提供理论基础。