孙全鹏，樊 超，展德玺，范怡明，孙伟峰

(1.郑州大学第一附属医院 麻醉科, 河南 郑州 450044；2.郑州市骨科医院 麻醉科, 河南 郑州 450044；3.郸城县人民医院 麻醉科, 河南 周口 477150)

外科手术是肝癌和其他实体肿瘤的主要治疗手段[1]。然而，手术切除本身可能导致癌细胞进入血液循环促进肿瘤扩散，同时围手术期全麻药和阿片类药物的使用可抑制机体免疫应答，促进癌细胞的扩散和转移[2]。回顾性分析表明，局部麻醉可降低癌术后复发风险，提高患者生存率[3]。罗哌卡因(ropivacaine)是一种新型酰胺类局麻药，其通过阻断神经兴奋与传导，具有广泛的镇痛和治疗功能。最近研究表明，罗哌卡因可抑制肝癌细胞活力和迁移能力，破坏线粒体功能，诱导细胞凋亡[4]。然而，其抗肿瘤作用机制并未完全阐明。长基因间非编码RNA 00853(long intergene non-coding RNA 00853，LINC00853)是一种新型RNA转录本，肝癌组织中LINC00853表达增加，且血清和细胞外囊泡衍生的LINC00853是肝癌潜在的新型诊断标志物[5]。然而，LINC00853在肝癌进展中的作用鲜有研究。本研究以LINC00853为切入点，从细胞增殖、迁移侵袭角度探讨罗哌卡因在肝癌中的抗肿瘤作用，为罗哌卡因在肝癌患者围手术期麻醉中的应用提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

盐酸罗哌卡因注射液(AstraZeneca AB公司)；人肝癌细胞系Hep3B(中科院上海细胞研究所)；细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(日本同仁生物公司)；所有序列片段、质粒(广州锐博生物公司)；Transwell小室(美国密理博公司)；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京宝日医生物技术有限公司)；兔源增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单抗、兔源基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)单抗和兔源MMP9单抗、羊抗兔IgG二抗(上海艾博抗生物公司)

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组和处理：Hep3B细胞用含10%胎牛血清的高糖杜尔比格伊戈尔培养基(DMEM)放入含5% CO2、37 ℃、无菌恒温培养中培养。消化80%汇合的Hep3B细胞，按照1∶5稀释转移至新的培养皿中，每周换液2次。用含0、100、200、400和800 μmol/L罗哌卡因的培养基分别孵育对数期Hep3B细胞48 h，确定罗哌卡因使用浓度(400 μmol/L)。将Hep3B细胞分为对照(不做处理)组、罗哌卡因(400 μmol/L罗哌卡因孵育48 h)组、si-NC组(转染si-NC)、si-LINC00853组(转染si-LINC00853)、pcDNA-NC组(转染pcDNA-NC)、pcDNA-LINC00853组(转染pcDNA-LINC00853)、(罗哌卡因+pcDNA-NC)组(用含400 μmol/L罗哌卡因的培养液孵育转染pcDNA-NC的Hep3B细胞48 h)、(罗哌卡因+ pcDNA-LINC00853)组(用含400 μmol/L罗哌卡因的培养液孵育转染pcDNA-LINC00853的Hep3B细胞48 h)。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：将未转染的Hep3B细胞接种96孔板，贴壁后用罗哌卡因终浓度为0、100、200、400和800 μmol/L培养基(100 μL/孔)孵育细胞48 h。将转染si-NC、si-LINC00853、pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B细胞接种96孔板，培养48 h。将转染pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B细胞接种96孔板，贴壁后用罗哌卡因终浓度为400 μmol/L培养基(100 μL/孔)孵育48 h。设置3个复孔。每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h，酶标仪在450 nm处测量吸光度(A)值。增殖抑制率=(1-A实验组/A对照组)×100%

1.2.3 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：每组取200 μL细胞悬液(细胞数约为1×104，不含胎牛血清)接种涂有基质胶(检测侵袭)或未涂基质胶(检测迁移)的Transwell小室中；将500 μL培养基(含有20%胎牛血清)加入到24孔板下室作为诱导剂。将Transwell小室至于培养箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基质胶和细胞，甲醇固定Transwell膜下表面细胞30 min，结晶紫染色20 min。倒置显微镜下计数，以5个视野的均值表示侵袭或迁移细胞数。

1.2.4 RT-qPCR检测LINC00853表达：按照Trizol试剂盒步骤提取总RNA，利用反转录试剂盒将1 μg RNA反转录成cDNA。利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和下述引物说明进行RT-qPCR反应。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算LINC00853相对表达量。引物序列如下：LINC00853上游5′-AAAGGCTAGGCGATC CCACA-3′，下游5′-ACTCCCTAGCTTGGCTCTCCT-3′；β-actin上游5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTA CGA-3′，下游5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAAT GG-3′。

1.2.5 Western bolt检测PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达：用RIPA缓冲液裂解各组细胞。每泳道40 μg蛋白样品，行SDS-PAGE，并在恒定电流下转膜。封闭膜后，加入兔源PCNA、MMP2和MMP9抗体(均为1∶2 000稀释)4 ℃孵育12 h。用二抗(1∶2 500 稀释)室温下孵育膜2 h。增强型化学发光试剂暗室显影，Image J软件分析PCNA、MMP2和MMP9蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 罗哌卡因对Hep3B细胞增殖的影响

相较于对照组，罗哌卡因处理后Hep3B细胞增殖抑制率显著升高，PCNA蛋白表达显著降低(P<0.05)，且表现出一定的浓度依赖性(图1，表1)。选择增殖抑制率约为50%的罗哌卡因浓度(400 μmol/L)进行后续实验。

图1 Western blot检测PCNA蛋白的表达

表1 罗哌卡因对Hep3B细胞增殖和PCNA蛋白表达的影响

2.2 罗哌卡因对Hep3B细胞迁移和侵袭以及蛋白表达的影响

与对照组比较，罗哌卡因组Hep3B细胞迁移和侵袭数量、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低(P<0.05)(图2，表2)。

A.cell migration and invasion were detected by Transwell assay(×200); B.MMP2 and MMP9 protein expressions were detected by Western blot

表2 罗哌卡因对Hep3B细胞迁移和侵袭以及蛋白表达的影响

2.3 罗哌卡因对LINC00853表达的影响

与对照组比较，罗哌卡因组Hep3B细胞LINC00853表达为0.35±0.03显著低于对照组的1.00±0.11(P<0.05)。

2.4 LINC00853对Hep3B细胞增殖、迁移、侵袭及蛋白表达的影响

与si-NC组比较，si-LINC00853组Hep3B细胞LINC00853表达水平以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表达显著降低，迁移和侵袭细胞数显著减少，增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-LINC00853组Hep3B细胞LINC00853表达水平、以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表达显著升高，迁移和侵袭细胞数显著增加，增殖抑制率显著降低(P<0.05)(图3，表3)。

表3 LINC00853对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图3 Western blot检测PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3细胞中的表达

2.5 LINC00853高表达可以降低罗哌卡因对Hep3B细胞增殖、迁移、侵袭及蛋白表达的影响

与(罗哌卡因+pcDNA-NC)组比较，(罗哌卡因+pcDNA-LINC00853)组Hep3B细胞LINC00853表达水平显著升高，增殖抑制率显著降低，迁移和侵袭细胞数、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达显著升高(P<0.05)(表4，图4)。

表4 LINC00853高表达可以逆转罗哌卡因对Hep3B细胞增殖、迁移、侵袭及蛋白表达的影响

图4 Western blot检测PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3B细胞中的表达

3 讨论

罗哌卡因通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭、耐药在多种人肿瘤中具有抗肿瘤作用。临床相关浓度罗哌卡因通过抑制细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)磷酸化可降低胃癌细胞HGC-27的增殖和迁移能力，但对细胞侵袭影响的大小无统计学意义[6]。罗哌卡因以剂量依赖性方式抑制甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭，加速细胞凋亡[7]。此外，罗哌卡因还可增强5-氟嘧啶和紫杉醇对食管癌细胞的抗增殖和促凋亡作用[8]。本研究表明罗哌卡因以剂量依赖方式抑制肝癌细胞Hep3B增殖能力。进一步研究发现，约50%增殖抑制率时罗哌卡因浓度还可显著降低Hep3B细胞的迁移和侵袭能力。PCNA是一种细胞核非组蛋白，其参与DNA合成、复制和修复，是细胞增殖的重要标志，下调PCNA表达可降低肝癌细胞的增殖能力[9]。MMP2和MMP9通过降解细胞外基质和基底膜介导肿瘤细胞侵袭和转移[10]。本研究中，罗哌卡因明显下调PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达，这进一步说明罗哌卡因对Hep3B细胞具有增殖、迁移和侵袭抑制作用，与报道[4]一致。

LncRNA通常定义为长于200个核苷酸且缺乏蛋白编码功能的RNA分子，其通过影响表观遗传、转录或转录后调控参与细胞增殖、凋亡、代谢、迁移和侵袭等多种细胞生物学过程[11]。利多卡因通过上调lncRNA人母系表达基因3(maternal expression gene 3，MEG3)表达可抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[12]。本研究中发现，罗哌卡因处理后Hep3B细胞中LINC00853表达水平显著降低，提示罗哌卡因的抗肿瘤作用与调控LINC00853表达有关。进一步研究显示，下调LINC00853表达可显著降低Hep3B细胞的增殖、迁移和侵袭能力，下调PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达水平，而上调LINC00853具有相反作用，提示LINC00853在肝癌中具有致癌作用。此外，上调LINC00853表达还可部分减弱罗哌卡因对Hep3B细胞增殖、迁移、侵袭以及相关蛋白表达的影响，这提示下调LINC00853表达可能是罗哌卡因在肝癌中发挥抗肿瘤作用的重要机制。然而，是否存在其他lncRNA介导罗哌卡因的抗肝癌作用仍有待研究。

总之，本研究证实罗哌卡因可抑制肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与下调LINC00853表达有关，这丰富了罗哌卡因的抗肿瘤作用机制，为罗哌卡因在肝癌患者围手术期麻醉中的应用提供了实验依据。