李 蓉，朱含月

(无锡市第二人民医院 药剂科,江苏 无锡 214002)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)多发生于中老年人群，以膝盖红肿、疼痛、活动受限、关节软骨退变、滑膜炎性反应等为主要病理症状的疾病[1]。KOA可导致患者关节畸形甚至残废，严重影响中老年人生活质量及生命健康[2]。目前研究发现Toll样受体4(Toll like receptors 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路参与KOA滑膜炎性反应及纤维组织增生过程[3]。酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine，KT)为非甾体类抗炎药[4]，对创伤性疼痛、术后疼痛、肿痛、剧烈痛等各种疼痛有较好的治疗效果[5]。但KT对KOA过程中滑膜炎性反应及疼痛的影响，未见报道。本研究建立KOA大鼠模型，对此进行探究，以期为临床合理用药提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 动物：清洁级雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g[无锡市第二人民医院动物中心提供批号为IACUC-01(20160917)]。本研究经无锡市第二人民医院动物伦理委员会批准同意。

1.1.2 主要试剂：KT注射液(上海恒斐生物科技有限公司，纯度：≥99.9%)；柳氮磺胺吡啶(上海彩佑实业有限公司)；BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶(Pierce公司)；苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin staining，HE)染色试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(上海笃玛生物科技有限公司)；白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司)；TLR4抗体、NF-κB p65抗体、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、神经突蛋白(neuritin)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、N-钙黏素(N-cadherin)、整合素金属蛋白酶4(integrin metalloproteinase 4,ADAM4)抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：参照文献[6]，于右膝关节内侧取长约2 cm的纵切口，用改良Hulth法建立大鼠KOA模型，术后1周，若出现膝关节红肿、步态不协调、跳跃现象，表明造模成功，将建模成功的大鼠用随机数字表法，分为模型组、KT低(1 mg/kg)、高(4 mg/kg)剂量组、TAK-242 组(TLR4拮抗剂，1 mg/kg)，每组10只；另取10只大鼠，只暴露膝关节，作为对照组。造模成功后(术后第8 d)开始给药，KT参照文献[7]设置剂量，并用0.9%氯化钠溶液配制为0.10、0.40 mg/mL的混悬液，以10 mL/kg的体积经右膝关节肌肉处注射给药1次/d，TAK-242组参照文献[8]设置剂量，并经尾静脉注射给药2次/周；对照组与模型组肌肉注射给予等量0.9%氯化钠溶液1次/d，各组连续给药2周。

1.2.2 大鼠膝关节肿胀程度观察及自发疼痛行为步态评分的检测：末次给药12 h后，观察大鼠膝关节红肿、肿胀程度，参照文献[9]将大鼠置于17 cm/s的电动跑步机上行走20 s，观察大鼠步态行为，并进行评分，总分以4分计，得分越高其疼痛行为越严重。

1.2.3 大鼠热刺激撤足痛阈值的检测：行为步态评分后，参照文献[9]利用鼠爪热辐射刺激测痛仪检测大鼠后肢足跟部皮肤对热刺激的反应，记录大鼠鼠爪撤足的反应时间，即热痛阈(heat-pain threshold,hppt)。

1.2.4 HE及马森(Masson)染色观察大鼠滑膜组织形态及组织纤维增生情况：麻醉处死大鼠，剥离完整滑膜组织(髌骨以下一层平滑光亮且呈浅淡黄色的组织)，剪取0.5 g滑膜组织，于液氮中保存备用，剩余组织立即放入4%多聚甲醛中固定24 h后，进行常规透明、浸蜡、包埋、切片(5 μm)。取部分切片，按HE及马森染色试剂盒说明书行染色、封片后，置于显微镜下观察组织染色情况。

1.2.5 免疫组化法检测大鼠滑膜组织neuritin蛋白表达：取1.2.4中剩余切片，常规处理后，加入一抗抗体(neuritin、1∶500)4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(1∶1 000)，室温孵育30 min，用DAB显色、苏木精复染、封片后。于400倍光镜下拍照，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统以5个视野阳性表达的平均吸光度值[absorbance(A)value]表示neuritin蛋白表达水平。

1.2.6 ELISA检测大鼠滑膜组织炎性因子IL-1β、TNF-α水平：取1.2.4中液氮中保存的滑膜组织，4 ℃解冻后，冰上匀浆、分离后取上清液，按ELISA试剂盒说明书方法检测IL-1β和TNF-α水平。

1.2.7 Western blot检测TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4蛋白表达 取组织上清液，用蛋白提取试剂盒轴提蛋白后，BCA法测蛋白浓度，取30 μg蛋白行电泳、转膜反应，加入抗体[TLR4、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4(1∶100)，β-actin(内参)1∶2 000]4 ℃孵育过夜，加入1∶1 000的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，增强化学发光法显色，以化学发光成像仪观察条带并拍照，Image-J软件分析蛋白表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 KT对大鼠膝关节肿胀程度、自发疼痛行为步态评分及热刺激撤足痛阈值的影响

对照组大鼠膝关节及活动步态行为正常；与对照组相比，模型组大鼠膝关节红肿，活动较少，行走步态不协调，自发疼痛行为步态评分升高，热刺激撤足痛阈值降低(P<0.05)；与模型组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组关节红肿、行走步态不协调行为缓解，自发疼痛行为步态评分降低，热刺激撤足痛阈值升高(P<0.05)(表1)。

表1 自发疼痛行为步态评分及热刺激撤足痛阈值比较

2.2 KT对大鼠滑膜组织病理形态的影响

对照组大鼠滑膜组织正常，未见明显炎性损伤。模型组大鼠HE染色可见滑膜组织充血肿胀、肥厚粗糙，滑膜细胞增生呈多层且排列不整齐，毛细血管丰富及炎性细胞浸润明显；马森染色可见纤维组织增生严重。与模型组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组大鼠滑膜组织肥厚、炎性细胞浸润及纤维组织增生等病理现象均不同程度减轻。其中KT高剂量组优于低剂量组，KT高剂量组与TAK-242 组病理损伤相近(图1)。

图1 大鼠滑膜组织病理损伤

2.3 KT对大鼠滑膜组织中neuritin蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠滑膜组织neuritin蛋白表达增高(P<0.05)；与模型组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组大鼠滑膜Neuritin蛋白表达降低(P<0.05)(图2，表2)。

图2 大鼠滑膜组织免疫组化图

表2 各组大鼠Neuritin蛋白表达结果比较

2.4 KT对大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α水平的影响

对照组相比，KOA组大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)；与KOA组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)(表3)。

表3 大鼠滑膜组织IL-1β、TNF-α水平比较

2.5 KT对大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达的影响

对照组相比，模型组大鼠滑膜组织TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组大鼠滑膜组织TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05)(图3，表4)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表4 大鼠滑膜组织TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平

2.6 KT对大鼠OPN、ADAM4蛋白表达的影响

对照组相比，模型组大鼠滑膜组织OPN、ADAM4蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组相比，KT低、高剂量组及TAK-242 组大鼠滑膜组织OPN、ADAM4蛋白表达降低(P<0.05)(图4，表5)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表5 大鼠滑膜组织OPN、ADAM4蛋白表达水平

3 讨论

KOA过程中，滑膜细胞及滑膜成纤维细胞活化，可分泌炎性细胞因子，如IL-1β、TNF-α等，来进一步促进滑膜炎性反应，引起关节结构损伤[10]。神经营养因子neuritin可间接反映疼痛程度，并参与KOA疼痛过程[11]。本研究发现，模型大鼠关节肿胀、活动受限、滑膜组织炎性细胞浸润及纤维组织增生等KOA病理症状严重，并伴随着自发疼痛行为步态评分升高、热痛阈值降低、滑膜组织IL-1β、TNF-α水平及疼痛相关指标neuritin表达升高，提示大鼠KOA造模成功。

KT是一种非甾体类抗炎药物，可用于各种疼痛的治疗[4]，但KT却在KOA中应用较少。本研究发现，KT剂量越高，大鼠KOA病理症状缓解越明显，滑膜组织炎性指标及疼痛相关指标表达降低越明显，这与报道，肌肉注射KT药物，可缓解关节置换术患者术后疼痛及炎性应激状态相一致[12]，提示KT也可用于KOA炎性反应及疼痛症状的缓解治疗。

TLR4/NF-κB通路是主要的炎性调控通路[13]，也是参与KOA滑膜炎性反应、滑膜细胞及滑膜成纤维细胞增生病变的关键通路。NF-κB通路激活可介导OPN表达，促进滑膜成纤维细胞炎性反应及增殖，可能是关节炎患者滑膜炎性增生及病变的关键原因[14]。NF-κB及炎性因子可触发TLR4炎性反应激活，并调控IL-1β炎性因子及ADAM4表达来促进滑膜增生及侵袭[15]。本研究发现，模型组大鼠滑膜组织TLR4/NF-κB通路及相关蛋白OPN及ADAM4蛋白表达均异常增高，用TAK-242 阻断TLR4/NF-κB通路激活后，大鼠KOA疼痛及滑膜炎性损伤缓解明显。而KT剂量越高，TLR4/NF-κB通路抑制效果越显著，且KT高剂量组对TLR4/NF-κB通路及KOA症状的抑制效果，与TAK-242组相近，提示KT药物缓解KOA大鼠滑膜炎性反应及疼痛症状，可能与阻断TLR4/NF-κB通路激活有关。

综上所述，KT可缓解KOA大鼠滑膜炎性反应及疼痛症状，且其缓解作用可能与阻断TLR4/NF-κB通路激活有关。这为KT在KOA领域的应用提供一定参考。但KOA病理过程较为复杂，还涉及免疫、自噬、氧化应激等多种生理反应，KT改善KOA症状的其他机制，有待继续研究。