张微 陶西 庞宗文

(广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁530004)

玫烟色棒束孢菌(Isaria fumosorosea)是一种国际上研究和应用都较为广泛的生防真菌，分布于世界各地，其寄主资源丰富，具有高毒力，能在环境中繁殖且不易产生抗性[1,2]。近年来，世界多个国家和地区致力于玫烟色棒束孢菌的研究，不断有新的玫烟色棒束孢菌株被分离、鉴定和注册登记，菌株的生长和培养条件、侵染途径和机理等特征逐渐明确。目前已发现玫烟色棒束孢菌可侵染柑橘木虱[3,4]、桃蚜[5]、烟粉虱[6]、小菜蛾[7]和茶卷叶蛾[8]等一些重要农业害虫，被广泛应用于害虫的生物防治中。

棒束孢菌的侵染机理主要是通过分生孢子萌发后直接穿入昆虫体表形成芽管，然后进入昆虫的血腔中，并在血腔中大量的增殖，最终导致昆虫的死亡[9,10]。可见棒束孢菌分生孢子的质量和产量是防治效果的决定性因素，因此大量收集分生孢子是棒束孢菌用于防治害虫的基础，而分生孢子产量取决于发酵工艺[11]。目前国内外使用较广泛的发酵方法有液体发酵法、固体发酵法及液固双相发酵法[12,13]。采用固体发酵优势在于固体发酵中的生长条件类似于微生物自身的天然环境，可使微生物较好地适应且固体发酵法设备和操作简单、成本低，其培养基组成常采用廉价的基质如麦麸、稻壳、玉米粉和大米等农业副产品，增加了农产品附加值且提高了资源利用率[14,15]。

本研究以玫烟色棒束孢菌为出发菌株，采用固体发酵技术，先采用单因素试验探究了麦麸和玉米粉的不同配料比及发酵条件对产孢的影响，并以产孢量为指标，采用正交试验对其发酵工艺条件进行优化，确定棒束孢菌的最佳发酵工艺条件，为棒束孢菌生防菌剂的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

玫烟色棒束孢菌(菌株保藏编号GDMCC 3.428)购自广东微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂

麦麸、玉米粉、马铃薯(市售)；吐温-80(CP)、胰蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、琼脂(BR)购自试剂公司。

1.1.3 培养基

PDA培养基：称取200g去皮的马铃薯切块，加入适量自来水煮沸30min后用纱布过滤杂质并收集滤液，向其中加入20g葡萄糖，20g琼脂，用自来水定容至1000mL，pH自然。

PPDA培养基：在PDA培养基的基础上添加10g·L-1的蛋白胨。

PPD培养基：PPDA培养基去掉琼脂。

1.2 方法

1.2.1 一级种子液

在无菌条件下，用0.05%吐温-80溶液洗脱在PPDA 培养基上培养7d的棒束孢菌分生孢子，振荡均匀后用血球计数板测定，调配制成 1×107个·mL-1的孢子悬浮液，接种于20mL的PPD培养基，25℃、180r·min-1振荡培养48h，制得一级种子液。

1.2.2 二级种子液

按照5%的接种量将一级种子液转接入100mL PPD培养液中，25℃、180r·min-1继续振荡培养72h，即为二级菌种培养液，用于固态发酵。

1.2.3 固态培养基的配制

将配制好的培养基装入250mL三角瓶，每瓶装样量为8g，8层纱布包扎放入高压灭菌锅121℃灭菌30min，每个处理3个重复。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 麦麸与玉米粉的不同比例对产孢的影响

固体培养基以麦麸为主要组分，通过添加不同比例的玉米粉为辅料，培养基组分及配比分别为麦麸∶玉米粉=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，灭菌后按10%接种量，于25℃的条件下发酵10d后测定各组合的产孢量。

1.2.4.2 含水量对产孢的影响

以筛选出的最佳培养基配方作为固体培养基，在固体基质中加入一定量的水，使培养基含水量分别为45%、50%、55%、60%、65%、70%，灭菌后按10%接种量，于25℃条件下发酵10d后测定各含水量条件下的产孢量。

1.2.4.3 接种量对产孢的影响

在明确最优培养基和含水量后，在此基础上设置接种量为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，于25℃条件下发酵10d后测定各接种量条件下的产孢量。

1.2.4.4 发酵温度对产孢的影响

在明确培养基配方、含水量和接种量的基础上，发酵温度设置为20℃、25℃、28℃、30℃、32℃，发酵10d后测定各温度条件下的产孢量。

1.2.4.5 初始pH对产孢的影响

在优化以上条件的基础上，调整培养基用水的pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，发酵10d后测定各pH条件下的产孢量。

1.2.4.6 发酵时间对产孢的影响

根据上述步骤确定的最佳发酵培养基配方、含水量、接种量和温度的基础上，发酵时间分别为5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d，发酵终止后测定各发酵时间条件下的产孢量。

1.2.5 正交试验设计

根据单因素确定的对产孢量有显著影响的培养条件(含水量、温度和时间)进行L9(33)正交试验，各因素和水平的选择见表1。

表1 正交试验的因素和水平设计

1.2.6 检测方法

产孢量的检测：培养完成后，准确称取1g固体发酵基质放入250mL的三角瓶中，加入50mL体积分数为0.05%吐温-80中和若干玻璃珠，置于25℃、180rpm摇床震荡3h后取出，用纱布过滤洗脱孢子，利用血球计数板对滤液中的孢子进行计数。另准确称取5g固体发酵基质置105℃烘干至恒重，测定固体发酵基质的含水量，通过计算得到1g干曲所含孢子数。

2 结果与分析

2.1 麦麸与玉米粉的不同比例对产孢的影响

以未添加玉米粉的培养基为对照，麦麸与玉米粉的不同比例对棒束孢菌产孢的影响见图1。从图1可以看出，当麦麸∶玉米粉为7∶3时产孢量最高。随着玉米粉量的增加，产孢呈先增加后递减的趋势，其原因可能是培养基中添加适量的玉米粉后可提供菌体生长所需的营养物质，而玉米粉过多时，培养基粘性过大，透气性降低，不利于菌株的生长产孢。

图1 麦麸与玉米粉的不同比例对产孢的影响

2.2 含水量对产孢的影响

含水量对棒束孢菌产孢的影响见图2，从图2可以看出，当含水量为60%，最有利于菌株的生长和产孢。基质中含水量过低时，培养基较干燥，菌株不能更好地利用培养基的营养，菌体因缺水而造成生长受到限制，进而影响产孢量。当含水量过高时，培养基容易结块，透气性降低，不易通风，散热性差，局部温度高容易造成烧曲，从而影响产孢量。

图2 含水量对产孢的影响

2.3 接种量对产孢的影响

接种量对棒束孢菌产孢的影响见图3，从图3可以看出，在一定范围下随着接种量的增加产孢量逐渐增加，当接种量为10%时，产孢量最高，当接种量超过10%时，产孢量随着接种量的增加逐渐减少。这可能是因为接种量过少时，无法满足菌株的生长要求，菌体生长较为缓慢，因此产孢量不高；当接种量过高时，发酵前期菌丝大量生长，营养物质消耗快，影响后期发酵孢子的产生，因而产孢量降低。

图3 接种量对产孢的影响

2.4 发酵温度对产孢的影响

发酵温度对棒束孢菌产孢的影响见图4，从图4可以看出，菌株在20～32℃条件下均能生长，产孢量随着温度的提高呈先上升后下降的趋势，当温度为25℃产孢量达到最高。分析其原因可能是当温度过低时菌株生长缓慢，产生的菌体量少，不利于产孢。温度过高时，酶活性降低，菌株的生长受到抑制，进而影响产孢，故产孢量较低。

图4 发酵温度对产孢的影响

2.5 初始pH对产孢的影响

初始pH对棒束孢菌产孢的影响见图5，从图5可以看出，菌株对初始pH值不是很敏感， 产孢量变化不大，pH在4.0～8.0都能很好的生长，其中当pH为6.0时，产孢量达到最高。因培养基本身的自然pH值为6.0左右，故后续试验中将采取自然pH值。

图5 初始pH对产孢的影响

2.6 发酵时间对产孢的影响

发酵时间对棒束孢菌产孢的影响见图6，从图6可以看出，发酵时间为8d左右时，达到最大的产孢量。培养时间小于8d时，菌株处于快速生长期，发酵不完全，菌体不能充分产孢，因此产孢量较低。而当发酵时间超过8d，产孢量呈下降趋势，可能是培养时间过长，孢子散落粘附在瓶壁上，造成孢子量测定时的取样误差。

图6 发酵时间对产孢的影响

2.7 正交试验结果分析与验证

在单因素优化试验的基础上，选择对发酵结果影响最大的3个因素含水量(A)、温度(B)、发酵时间(C)，以产孢量为试验指标，设计3因素3水平L9(33)的正交试验进一步优化发酵条件，其试验设计方法和结果如表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果与分析

表3 方差分析结果

由表2和表3可知，3个因素对产孢量的影响顺序A>B>C，即温度对产孢量的影响最大，其次是含水量，影响最小的是发酵时间。方差分析结果表明，温度对棒束孢菌的产孢量具有显著影响(P<0.05)，含水量和发酵时间对该菌的产孢量影响都没达到显著性。通过正交试验设计得到，温度、含水量和发酵时间的最佳配比为A2B1C2，即温度为25℃，含水量为55%，发酵时间为9d。

2.8 正交试验验证

3 结果与讨论

随着棒束孢菌杀虫剂需求量的不断增加，研究者越来越重视棒束孢菌的生产方法。固体发酵是一种极好的发酵工艺方法，可充分利用低成本的农业副产品进行生产。而培养基是影响棒束孢菌固体发酵的重要因素之一，培养基的优劣直接决定了菌株的产孢性能。张婧迪等[16]通过单因素筛选出金龟子绿僵菌菌株 CY-1的最佳固体发酵培养基为玉米粉:稻壳=8∶2，产孢量可达7.45×109孢子·g-1。邓小军[17]等利用麦麸、红壤、谷糠为作为球孢白僵菌BbⅢ22发酵固体培养基发现，在m(麦麸)∶m(谷糠)∶m(红壤) =2∶4∶4时产孢量最高，但在谷糠基质中不生长。本研究采用麦麸为主，加入一定量的玉米粉的培养基配方进行了初步研究，通过添加一定量的玉米粉可以有效提供充足养分，发现当麦麸和玉米粉为7∶3时产孢量最大。可见固体发酵基质的不同，产孢量也不近相同。同时，菌体的生长受含水量、接种量、温度、发酵时间和pH等因素的影响。冀媛媛等[18]分析了接种量、初始含水量、培养时间和初始pH对放线菌SC1-1产孢的影响，得到最佳发酵条件为初始含水量400mg·g-1、接种量0.4mL·g-1、温度28℃、培养时间192h、初始pH 7.6。景芳等[18]研究表明，当发酵条件为含水量60%、接种量30%、温度28℃、pH 5.6时长枝木霉T6生防菌剂产孢量最高。因此，选择适合菌株自身生长的最佳发酵条件，有利于提高菌体产量，使菌株的生防潜力获得充分的发挥。本研究通过单因素试验和正交试验获得了棒束孢菌产孢量的最佳培养基配方及发酵工艺条件，为工业化生产棒束孢菌生防菌剂奠定了基础。

4 结论