洪克前　谷会　陈 丽　姚全胜

摘  要：菠萝是中国最具有特色和竞争优势的热带水果之一，但采后菠萝果实不耐贮藏，极易发生黑心病，严重影响果实品质和商品率，而且威胁菠萝产业的健康发展。因此减少采后菠萝损失直接关系到热区农民的经济收入。黑心病是采后菠萝果实一种常见的生理性病害，由于该病的生理机制尚不清楚，所以国内外尚未有完全控制黑心病发生的方法。目前关于菠蘿黑心病的研究主要集中于黑心病生理过程描述和采后实用处理技术领域，而对其机理认识不足，严重制约了对黑心病问题的根本解决。前期的研究表明，菠萝果实基因可能参与了黑心病发生，但对其生理功能尚未解析。为了探究基因在采后菠萝果实黑心病中作用，制备了基因多克隆抗体。基因全长为2439个核苷酸，编码813个氨基酸，预测其分子量约为91 kDa，选取一个亲水性较高的片段即全长中N端第1～333个氨基酸序列，分子量大约57 kDa;将该序列片段插入到原核表达载体pET-30a（+）多克隆位点HⅠ和RⅠ之间，构建了原核表达载体pET-AcPLD2，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达菌体蛋白。经SDS-PAGE电泳检测，结果表明重组蛋白成功获得了高效表达，分子量约为57 kDa。重组蛋白经纯化后免疫新西兰兔，获得了多克隆抗血清，采用Protein A/G纯化法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗血清通过间接酶联免疫分析，测定其效价比可达1∶1 600 000，表明所制备的抗体具有很好的灵敏性。进一步采用不同黑心病症状的菠萝果实组织总蛋白进行蛋白质印迹分析显示，在分子量91 kDa左右处出现特异的蛋白质条带，表明所制备的抗体可与菠萝AcPLD2蛋白特异性结合，且具有良好的特异性，暗示AcPLD2蛋白可能参与菠萝果实黑心病有一定的关系该研究结果扩展了基因功能的认识，有利于进一步阐明采后菠萝果实黑心病的发生机制。

关键词：菠萝;基因;原核表达;多克隆抗体;黑心病

中图分类号：S311      文献标识码：A

Preparation of the Polyclonal Antibody and Expression Profiles of Gene in Internal Browning of Pineapple Fruits

HONG Keqian GU Hui  CHEN Li YAO Quansheng

South Subtropical Crops Research Institutes， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products of Hainan Province， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Pineapples are one of the fruits with the most characteristic and competitive edge in China. Postharvest pineapple fruits are susceptible to internal browning （IB）， which seriously affects fruit quality and commodity rate and further threatens the healthy development of pineapple industry. Therefore， it is important that declining the loss the postharvest pineapple fruits which is directly related to economic income of farmers in thermal region. IB which is a complex physiological disorder during postharvest storage periods， causes the considerable losses to pineapple producing countries. An effective method that can eliminate IB occurrence is unavailable to date. Nowadays， the study on IB is focused on description of physiological process and practical treatment technology of IB. Lack of understanding of IB mechanism restricts the utterly resolution of the disorder. We have reported that in pineapple fruits is putatively involved in IB of pineapple during postharvest storage previously. However， the physiological function of gene in IB has not been analyzed till now. To investigate the role of gene in IB of the postharvest pineapple fruits， its polyclonal antibody was prepared. The Full-length of gene includes 2439 nucleotides and encodes 813 amino acids （AAs）， with the predicted molecular weights of 91 kDa， of which the N terminal amino acid starting from one AA to 333 AA and an about 57 kDa with high hydrophilicity fragment was selected. The fragment of gene was inserted into the polyclone sites between H I and R I of the prokaryotic expression vector pET-30a（+） for constructing the recombinant plasmid pET-AcPLD2. The recombinant plasmid was transformed into BL21 （DE3） cells to induce the protein expression. The expression product was identified with high efficiency and an about 57 kDa by SDS-PAGE. The fusion protein was obtained using Protein A/G purification method， then the purified fusion protein was used as the antigen to prepare the polyclonal antiserum in rabbits. Indirect ELISA test indicated that the purified antiserum had good sensitivity with a titer of 1∶1 600 000. Further western blot assay showed that a 91 kDa peptide was specifically detected in the total proteins of different IB pineapple fruits with anti-AcPLD2 polyclonal antibody， indicating that the antibody could react to the total proteins expressed in pineapple specifically， suggesting that AcPLD2 protein may be involved in regulating in IB of pineapple fruits. Data from the present study will expand the knowledge of gene， which throws more light on the reasons for IB in the postharvest pineapple fruits.

pineapple; gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; internal browning

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.003

磷脂酶D（PLD; EC3.1.4.4）是一类植物组织中普遍存在，催化细胞膜的主要组分磷脂类物质水解，产生磷脂酸和亲水性的胆碱等的酶类，目前已在多种植物如水稻、玉米、拟南芥、甘蓝、烟草、番茄、草莓、龙眼和菠萝等获得基因cDNA全长序列。植物PLD除了具有水解酶功能外，还参与细胞的一系列代谢活动，如生长发育，多种激素信号途径，包括脱落酸、水杨酸和生长素等，环境胁迫包括干旱、低温、磷饥饿、抗病、脂质信号调控、次生代谢、油脂代谢和免疫反应等一系列生理活动。因此，深入研究植物基因对逆境的反应及其生理功能，对筛选抗逆相关基因以及提高作物的抗逆性有重要的指导意义和应用价值。

采后菠萝（ L.）果实贮藏期间极易遭受黑心病（一种复杂的生理性紊乱）侵袭，从而限制了其贮藏期并导致品质劣变，损失巨大。本研究从菠萝果实中分离到10个基因家族成员，命名为～;实时荧光定量PCR分析，结果表明基因表达与采后菠萝果实黑心病密切相关。为了进一步在蛋白质水平上研究基因功能，本研究中根据基因序列，选择其亲水性较高的序列插入到原核表达载体pET-30a（+）中，构建pET-AcPLD2原核表达载体，诱导表达并纯化目的蛋白，并制备了基因多克隆抗体，并采用采后菠萝果实贮藏过程中不同黑心病症状样品进行Western blot分析，检测目的蛋白的表达情况，旨在为进一步研究基因的生理功能奠定基础。

  材料与方法

  材料

1.1.1  植物材料  供试的菠萝品种为‘巴厘’（ L. cv. ‘Comte de Paris’），果实于2018年8月采自广东省徐闻县一菠萝果园（2034¢ N;11017¢ E），采收成熟度为绿熟，即果眼较平且果皮的绿色面积占比达90%以上。

1.1.2  主要试剂  质粒pET-30a（+），DH5α，BL21（DE3）均由Abmart公司提供。限制性内切酶HⅠ、R I购自诺唯赞生物有限公司;T DNA连接酶、载体pMD18-T、胶回收试剂盒、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司;脱脂奶粉、Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自北京全式金生物技术有限公司;PVDF膜蛋白質、Marker购自Bio-Rad公司;辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体购自Promega公司;化学发光检测试剂盒（ECL）购自Thermo Scientific公司;其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

 方法

1.2.1  材料处理  菠萝果实采收后3 h内运至南亚热带作物研究所实验室，立即挑选大小相近、无机械损伤和无病虫害的果实，采用0.05%（/）施保功浸泡2 min进行表面杀菌，然后用无菌水冲洗干净后，置于常温下晾干备用。用聚乙烯薄膜袋包装放入25℃恒温箱中贮藏。分别在贮藏第0、3、6天时取样。取样时将菠萝果实中部横切，选取距离果心约15 mm范围内的果肉部分用液氮速冻并储存于‒80℃备用。本实验设3个生物学重复，每个重复20个果实，共180个果实。

1.2.2  基因片段的扩增  根据已克隆的基因（登录号：Aco018572.1）全长（813个氨基酸）中N端第1～333个氨基酸之间的cDNA序列，引入R I和HⅠ酶切位点。正向引物：5¢-GGAATTCCATGGCTACAGAGG ATTCT-3¢，反向引物：5¢-CGCGCTCCGTC CCGACCTCG-3¢（下划线为酶切位点）。以绿熟阶段的菠萝果肉cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳检测，回收并纯化目的DNA片段，与pMD19-T载体连接，构建重组质粒pMD- AcPLD2。经PCR扩增和酶切2种方法检测确认已插入正确的质粒，经测序，确认阳性克隆提取质粒DNA。

1.2.3  pET-AcPLD2原核表达载体的构建  使用质粒提取试剂盒提取测序正确包含基因的T载体重组质粒，用R I和HⅠ进行双酶切，回收特定的基因片段，与经R I和HⅠ双酶切的pET-30a（+）载体，利用T DNA连接酶在16℃下进行定向连接，获得原核表达载体pET-，预测重组蛋白的分子量约为57 kDa。经PCR和酶切鉴定后选取正确的质粒DNA，重组蛋白pET-转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。

1.2.4  pET-AcPLD2融合蛋白的诱导表达  分别挑取阳性重组质粒pET-和空白载体pET-30a（+）的 BL21，接种至2 mL含有卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的液体培养基中，37℃震荡培养8 h。从中取500 mL，按1∶100的比例接种于相同的新鲜LB液体培养基中，放置于37℃振荡培养至为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L后，置于37℃诱导培养4 h。收集2 L菌液，12 000×离心1 min，弃上清液，收集沉淀，用100 μL 2×SDS凝胶加样缓冲液重悬，尽量使菌块全部悬起，混匀后沸水浴5 min，12 000×离心1 min。取上清液进行SDS-PAGE（3%浓缩胶，12%分离胶）电泳检测目的蛋白表达情况。

1.2.5  pET-AcPLD2重组蛋白的纯化  按照高宁等的方法进行，将重组蛋白pET-AcPLD2的菌体诱导4 h后，裂解液破碎重组蛋白的菌体，12 000×离心10 min，收集上清液，0.45 μm滤膜过滤去除杂质后，进一步采用Protein A/G纯化蛋白。将纯化的蛋白用12% SDS-PAGE进行分离，将电泳后的凝胶用蒸馏水淋洗干净，在预冷的0.25 mol/L KCl中浸泡染色2～5 min后即可显色，显色后从凝胶上切下目的条带，然后用12% SDS- PAGE检测所分离的重组蛋白产物浓度。

1.2.6  多克隆抗体制备、效价测定  取纯化的AcPLD2融合蛋白（约600 μg）作为抗原，免疫接种成年新西兰雄性兔2只，2周后加强免疫1次，免疫5次后从颈动脉插管收集全血，分离血清，‒20℃保存。用Protein A/G纯化抗血清后获得AcPLD2多克隆抗体。抗体效价测定采用间接ELISA法。

1.2.7  Western blot检测  参考王卓等的方法提取菠萝果肉组织总蛋白，采用Bio-Rad公司的Quick Start Bradford蛋白定量试剂盒测定所提取的蛋白含量，以BSA为标准品建立标准曲线。参考洪克前等的方法进行Western blot分析：取50 μg菠萝果肉组织总蛋白进行SDS-PAGE，通过电转移法将菠萝组织总蛋白转印至0.2 μm PVDF膜上。电转转后的PVDF膜放入3%的脱脂奶粉中封闭3 h。以本实验制备的AcPLD2多克隆抗体为一抗（1∶3000），室温下在摇床上轻摇反应3 h，然后用TBST（TBS+0.05% Tween-20）洗膜3次，每次8 min。用TBST把HRP标记的羊抗兔IgG按照1∶3000的比例进行稀释，室温孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次8 min。把洗好的膜用化学发光剂ECL孵育膜3 min，在暗室用X光胶片曝光检测。

 结果与分析

2.1  基因片段的分离

RT-PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到长度约为1000 bp DNA条带，与预期结果相符。将此片段连接到pMD19-T载体上，选择阳性克隆测序，经菌液PCR及测序验证显示核苷酸序列与原序列完全一致（图1）。表明已成功分离到菠萝基因片段cDNA序列，具有正确编码框和酶切位点，可用于后续试验。

原核表达载体的鉴定

pET-30a（+）為5.9 kb左右的具有多克隆位点的原核表达载体。将测序正确的包含基因的T载体重组质粒酶切，然后将基因片段插入到同样经双酶切的原核表达载体pET-30a（+）上，构建原核表达载体pET-，转化大肠杆菌DH5α受体细胞，37℃、100 r/min培养8 h，挑取单克隆并对构建的pET-质粒进行HⅠ和R I双酶切，产物呈现出清晰的2条带，分别为pET-30a（+）（5900 bp）和（999 bp）（图2），表明目的基因与载体连接成功，并将测序正确的阳性克隆质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。

重组蛋白的诱导表达与纯化

将含有pET-原核表达载体的大肠杆菌菌液和空载体pET-30a（+）经IPTG诱导4 h后，通过SDS-PAGE检测蛋白质的表达量。重组菌体诱导后超声波破碎、离心，收集上清，SDS-PAGE检测结果表明，该重组蛋白以可溶性形式表达;含有重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后产生大量分子量约57 kDa的表达产物，与预期目的蛋白大小一致，而空载体和未经IPTG诱导的重组质粒没有出现目标蛋白，表明目的基因在该表达系统中获得了正确表达。AcPLD2融合蛋白经大量诱导表达后，对所获得的重组蛋白用Protein A/G纯化后，进一步经SDS-PAGE电泳检测，结果证实得到了57 kDa的目的条带（图3），表明纯化效果较好，可用作抗原免疫新西兰白兔。

多克隆抗体制备及效价分析

将纯化后的AcPLD2融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔，得到抗血清，进一步经Protein A/G纯化获得多克隆抗体。以AcPLD2纯化蛋白包被96孔板（每孔浓度皆为0.1 μg/mL），以未免疫的正常兔血清为对照，以常规间接ELASA法测定抗体效价。由图4可看出，当抗体的稀释倍数达1 600 000时，值为0.5，即认为该稀释度为抗体的效价，利用这一浓度可有效地检测到抗原，表明本研究制备的抗体具有很高的检测灵敏度，可用于后续研究。

 菠萝组织黑心病进程中蛋白的表达分析

为进一步了解AcPLD2蛋白在菠萝黑心病中作用，选取不同黑心病症状的菠萝果实进行Western blot表达分析。刚刚采收的菠萝于25℃贮藏，第0天时，果肉中没有黑心病症状;贮藏至第3天时，肉眼可分辨黑心病症状，黑心指数约为0.2;贮藏至第6天时，其黑心病指数达0.9（图5）。采用Western blot技术分析上述不同菠萝果实不同黑心病症状的AcPLD2蛋白表达，结果表明，25℃贮藏第0～3天时，果肉中AcPLD2蛋白没有表达，贮藏至第6天时，果肉中检测到AcPLD2

蛋白的表达，分子量约为91 kDa。同时，AcPLD2重组蛋白表达清晰，分子量约为57 kDa（图6），进一步证实了本研究制备的抗体具有良好的特异性。上述结果表明，菠萝黑心病发生至第6天时，AcPLD2蛋白在菠萝果肉中显著表达。

讨论

采后菠萝果实极易发生黑心病，导致果实品质劣变，损失巨大。菠萝黑心病分子机制尚不清楚，因此，揭示黑心病分子机制不仅能提高果实贮藏品质和潜力，而且对于菠萝育种意义重大。目前，利用各种载体在各种表达系统获得融合蛋白是分子生物学常用技术，尤其是原核表达系统具有表达量高、成本低等优点，因此原核表达重组蛋白免疫动物来制备抗体已成为研究蛋白质性质与功能的一种行之有效的方法。

本研究采用原核表达系统，将基因亲水性较高的片段克隆到pET-30a（+）原核表达载体上，利用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，其ELISA效价比可达1∶1 600 000;Western blot表达显示，该抗体不仅能识别在大肠杆菌原核表达的AcPLD2融合蛋白，而且还可特异识别菠萝组织总蛋白中的AcPLD2蛋白，这些结果表明所制备的抗体效价高、灵敏度高和特异性好。

植物中PLD是一类重要的信号酶，参与多种逆境信号胁迫。自1994年在蓖麻中发现第一个PLD基因以来，植物中越来越多的PLD基因被注释。此外，目前对PLD所开展的调控机制的研究主要针对拟南芥和水稻等模式植物，对于重要的经济作物如果实等非模式植物这方面所开展的研究报道比较少。另外，植物中PLD功能研究多集中在生长、发育和逆境胁迫方面，而PLD参与调控采后果实品质仍然了解较少，尤其针对菠萝PLD的研究尚未见报道。本研究中，利用制备的AcPLD2多克隆抗体初步研究发现，菠萝果实在25℃贮藏6 d时，随着黑心指数的增加，AcPLD2蛋白表达明显可见，暗示AcPLD2蛋白参与黑心病进程，进而推测AcPLD2蛋白与采后菠萝果实的黑心病有一定的关联。有关AcPLD2蛋白参与菠萝果实黑心病的机制，将有待进一步研究。

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15. 收稿日期 2021-03-29;修回日期 2021-09-10

    基金项目 海南省自然科学基金项目（No. 320MS087）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项——中国热带农业科学院院

    级创新团队项目（No. 1630062017032，No. 1630062017031）。

    作者简介 洪克前（1968—），男，博士，副研究员，研究方向：热带果蔬采后贮藏与保鲜。*通信作者（Corresponding author）：

    姚全胜（YAO Quansheng），E-mail：yqsh1028@163.com。