李佳欢，王晓慧，姜明国，宋福强，常 伟

（1黑龙江大学生命学院/黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，哈尔滨 150080；2广西民族大学海洋与生物技术学院/广西多糖材料与改性重点实验室，南宁 530008）

0 引言

印度梨形孢(Serendipita indica)是1998 年Verma等人从印度西北部塔尔沙漠地区的灌木丛根部上分离得到的根内生真菌[1]，可以与宿主植物建立共生关系。共生体会促进植物生长、养分吸收，提高植物抗病性和耐胁迫能力，增加植物的生物量等[2]。

已有研究表明，以S.indica生物量为指标，采用响应面法(Response surface methodology, RSM) 对S.indica液体发酵条件进行优化，得到最佳培养条件是初始pH值为6.02、培养温度为27.55℃[3]。2019年舒珊等[4]报道发现V8 培养基是S.indica的最适培养基，培养5天后，已接近长满整个平板，且加入一定量的蔗糖有助于促进S.indica的生长。Swetha 等[5]报道通过筛选培养基成分能提高S.indica中淀粉酶和蛋白酶的产生。此外，接种S.indica可促进金柑(Fortunella japonica)、甘 薯(Ipomoea batatas)和 黑 麦 草(Lolium perenne)的生长发育[6-8]；提高烟草(Nicotiana tabacum)、棉花(Gossypiumspp.)和玉米(Zea mays)的抗旱性[9-11]，以及蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和核桃(Juglans regia)的耐盐性[12-14]；增强植物的抗病性[15-16]；还可以促进水稻(Oryza sativa)、甘蓝型油菜(Brassica napus)和生菜(Lactuca sativaL.var.ramosaHort.)对磷素的吸收[17-19]，减轻重金属对植物的毒害作用[20-22]。

S.indica具有与丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)类似的生物学功能，但AMF不能在人工培养基上纯培养极大制约了其在生物技术基础研究和农业生产中的应用。S.indica不存在这一问题，由于可以在合成培养基上进行培养并且完成生活史，使其在可持续农业生产领域具有广阔的应用前景，并取得了一定的研究成果[2]。碳源、氮源、各种无机盐等培养基成分对微生物细胞的生长、孢子的产生和代谢产物的积累有着强烈的影响[5]。目前，S.indica的培养通常采用的是Kafer 培养基与PDA 培养基，只适合于实验室小型试验阶段，由于生长速度较慢，继代周期长，需要通过有效手段加快S.indica在培养基上的生长速率[23]。因此，培养基成分的筛选及其优化是实现S.indica生物肥料规模化生产的重要前提和基础。

本研究通过对S.indica培养基进行筛选，探究培养基种类、温度、PH 值、碳源、氮源和无机盐共六种影响因子对S.indica生长的影响，并利用RSM设计三因素三水平试验，对S.indica培养基响应面分析试验结果进行分析，建立以S.indica生长速率为响应值的三元二次回归方程，通过回归分析对S.indica培养基进行精细优化，有效提高S.indica生长速率，为下一步对其进行田间应用试验，以及作为环保型生物菌剂的商品化开发和产业化应用奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

S.indica菌株由长江大学园艺园林学院吴楚教授赠送；培养基中碳源、氮源和无机盐均为市售产品，分析纯。试验在黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，于2019年3月—2020年12月份进行。

1.2 单因素试验设计

1.2.1 培养基 在温度28℃、pH 6.9条件下，将菌种接种到PDA 培养基、综合PDA 培养基、MMN 等培养基测定菌种的生长状况，配方如表1[24]。在培养箱中黑暗培养14天，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3组重复。

表1 供试培养基配方

1.2.2 温度 以MMN 固体培养基为基础，设定单因素试验中温度的梯度范围，分别为22、25、28、31、34、37℃，如表2 所示，在pH 6.9 条件下进行黑暗培养，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3次重复。

1.2.3 pH 以MMN 固体培养基为基础，设定单因素试验中pH的梯度范围，分别为6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3，如表2所示，在温度31℃条件下进行黑暗培养，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3次重复。

1.2.4 碳源 以MMN 固体培养基为基础，设定单因素试验中碳源分别为牛肉膏、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、秸秆，并以无碳培养基作对照，氮源和无机盐不变，如表2所示，进行培养，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3次重复。

1.2.5 氮源 以MMN 固体培养基为基础，设定单因素试验中氮源分别为尿素、硝酸钠、蛋白胨、磷酸氢二铵、酵母浸粉，并以无氮培养基作对照，碳源和无机盐不变，如表2 所示，进行培养，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3次重复。

表2 培养条件的的选择

1.2.6 无机盐 以MMN 固体培养基为基础，设定单因素试验中无机盐分别为硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙和氯化铁，并以无盐培养基作对照，碳源和氮源不变，如表2 所示，进行培养，每日用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落生长状况，每个试验下3次重复。

1.3 响应面试验设计

根据单因素试验确定各试验因素后结果，利用RSM 优化S.indica培养基，以S.indica的生长速率为响应值，采用Design Expert 10 软件中的Box-Behnken design 设计原理。在单因素基础上选择硫酸镁、磷酸二氢钾和硝酸钠3个因素为自变量设计三因素三水平试验。各取3个水平，以(-1，0，1)编码，设计了3因素3水平试验的响应面分析。根据单因素试验结果，选取第2 组的添加量作为中心组合设计试验的零水平，各因素所代表的参数、水平如表3所示。

表3 中心组合设计试验

1.4 响应面模型验证

根据Design Expert 10 软件所给出的各个成分的取值，配制培养基进行验证试验，做3 次重复，以检测培养基成分对S.indica生长速率的影响。将试验所得实际值与软件分析所得预测值进行比较，来验证模型的可靠性。

1.5 数据分析

上述各试验均做3 次重复，采用Design Expert 10软件辅助完成试验设计、模型建立和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同培养基对印度梨形孢生长速率的影响 由图1 可知，将S.indica接种至6 种固体培养基上培养，发现其在MMN培养基上生长最快，培养8天后，已接近长满整个平板；其次是PDA 和PDMA 培养基，培养9天后菌丝体也长满整个平板；再次是KM 培养基和改良MMN 培养基；在综合PDA 培养基上生长最慢，生长至8 天时直径只有4.42 cm。因此，本研究选择MMN培养基进行后续RSM试验。

2.1.2 温度、pH 对S.indica生长速率的影响 如图1 所示，S.indica菌株最适温度在31℃左右，此时S.indica菌株生长速率最快，在28℃～34℃内菌落都能生长，但在22℃和37℃的时候菌落在直径2.5 cm左右就停止生长。且该菌适合中性环境生长，其最适pH为6.9左右，此时S.indica菌株生长速率最快，菌落为无色，透明。从图中可知，pH 6.1～7.3时培养基上的菌落均能生长，但生长速率存在显著差异。因此，选择31℃为后续响应面条件；选择pH 6.9为最佳条件。

图1 培养基种类、温度和pH值对印度梨形孢生长速率的影响

2.1.3 不同碳源对S.indica生长速率的影响 如图2 所示，S.indica在麦芽糖、蔗糖和葡萄糖作为碳源的MMN 培养基上均生长迅速，在以蔗糖为碳源的培养基上生长速率最快，培养8天后，已长满整个平板。初期该菌落为白色，近透明，外围有菌丝蔓延，比无碳培养基颜色较深；而以麦芽糖为碳源的培养基上生长的菌落颜色微黄，较致密，生长速率较好；以秸秆为碳源的培养基上生长的菌落在直径为4.5 cm 左右停止生长。因此，将蔗糖作为最佳碳源。

2.1.4 不同氮源对S.indica生长速率的影响 如图2 所示，S.indica能够利用多种氮源，在尿素、硝酸钠和酵母浸粉作为氮源的MMN 培养基上均生长迅速，在以硝酸钠为氮源的培养基上生长速率最快，培养8天后，已长满整个平板。该菌落无色透明，比其他培养基颜色较浅，在不同供试氮源的培养基上菌落基本都能生长，仅生长速率存在差异，除无氮作对照之外，其他培养基上菌落生长状况差异不大，可看出S.indica对氮源利用范围广泛。因此选择硝酸钠为最佳氮源。

2.1.5 不同无机盐对S.indica生长速率的影响 如图2

图2 碳源、氮源和无机盐对S.indica生长速率的影响

所示，S.indica在以硫酸镁和磷酸二氢钾为无机盐的MMN 培养基中均生长迅速，在以硫酸镁为供试无机盐的培养基上生长速率最快，培养8天后，已接近长满整个平板。初期该菌落为白色，长势较好。而以氯化铁为无机盐的培养基上的菌落在直径为4.3 cm左右停止生长。因此选择硫酸镁为最佳无机盐。

2.2 响应面优化试验结果

根据Box-Behnken试验设计原理，选取硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钠进行三因素三水平的响应面分析方法，以接种菌株S.indica的生长速率大小作为响应值。试验设计及结果如表4所示。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

根据Box-Behnken 试验结果，采用Design Expert 10软件对结果进行响应面分析，得到等高线和响应面图，如图3、图4和图5所示。

从图3、图4和图5可知，等高线图均为椭圆形，表示3 个因素两两交互作用显著；曲线图均呈现凸面且开口向下，响应面中心点处于变量范围内，说明S.indica的生长速率在两因素交互作用中有最大值。

图3 硫酸镁和磷酸二氢钾交互影响S.indica生长速率的曲面图和等高线图

图4 硫酸镁和硝酸钠交互影响S.indica生长速率的曲面图和等高线图

图5 磷酸二氢钾和硝酸钠交互影响S.indica生长速率的曲面图和等高线图

采用Design Expert 10 软件对试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联式，得到回归方程式(1)。

由表5可知，回归模型值为P＜0.0001，说明该模型极显著。一次项X1、X2、X3，二次项X12、X22、X32和交互项X1X2呈现为极显著，X2X3呈现为显著。其中失拟项P=0.1873＞0.05 不显著，表明该模型可信度和拟合度较好，相对误差较小，可以很好的分析数据。通过对方程求解，得到S.indica的最佳培养基配方为：MgSO4·7H2O 为0.824 g/L、KH2PO4为1.118 g/L、NaNO3为1.055 g/L。

表5 方差分析表

2.3 试验结果验证

进行3 次重复验证试验，检验模型预测结果准确性，S.indica的平均生长速率为1.8083 cm/d，与预测值1.914 cm/d 比较接近，这表明模型之间有较好的拟合性，优化模型可行性好。

3 讨论

通过研究显示，应用RSM 优化培养基多有报道，但利用此方法对S.indica进行优化研究却少见报道[26]。2018 年，张玲秀等[3]采用RSM 对S.indica液体发酵技术参数进行优化，以生物量为响应值，得到最佳pH 6.02、培养温度为27.55℃，转速178.2 r/min，与本研究通过固体平板培养S.indica所得结果存在差异。2019年，舒珊等[4]报道在V8培养基中加入蔗糖有助于S.indica的生长，而本研究将蔗糖作为唯一碳源，与其他碳源相比，对S.indica生长的效果更好。此外，目前大多数S.indica常用的培养基是PDA 培养基，将S.indica菌株接种在PDA平板上，在28℃下14天长满平板[25]，与本试验进行单因素优化时，在相同条件下所得结果基本一致，而本研究通过RSM优化S.indica培养基后，接种的S.indica菌株生长速率提高了近两倍。

本试验的局限性在于仅应用RSM 对培养基中的碳源、氮源和无机盐等成分进行优化，未应用RSM 对培养条件如温度、pH和接种量等进行优化。后续可通过进一步优化温度和pH，更精确S.indica的培养条件，提高S.indica的生长速率。此外，本试验的局限性还在于仅通过菌落直径来反映S.indica的生长速率，不能说明菌落直径大其生物量和孢子数也同样多。后续可通过液体培养测定S.indica的干重，与菌落直径共同作为反映S.indica的生长速率大小的指标，可靠性更强，更利于生产应用。

本研究结果表明，RSM 可用于作为确定S.indica优化培养基配方的方法。应用RSM 最后对模型进行验证，试验所得S.indica的生长速率与预测值基本一致，说明模型能较好地预测S.indica生长速率的实际情况，具有较好的生产指导意义。通过RSM 对S.indica培养基进行优化，培养4天后，S.indica已接近长满平板，实际生长速率可达到1.8083 cm/d，远大于原MMN 培养基继代培养的平均生长速率。因此，本研究可为S.indica下一步在田间试验中大量扩繁提供理论参考。

4 结论

基于响应面Box-Behnken Design中心组合设计优化印度梨形孢(Serendipita indica)培养基，最佳配方为：MgSO4·7H2O为0.824 g/L、KH2PO4为1.118 g/L、NaNO3为1.055 g/L、NaCl 为0.03 g/L、CaCl2为0.05 g/L、蔗糖为10 g/L；最适生长温度在31℃左右，最适pH在6.9左右；在此条件下，S.indica的平均生长速率最快。本研究利用RSM 筛选得到的最适培养条件，为后续S.indica液体发酵条件优化以及对其进行生物菌剂规模化生产提供了实验基础和理论参考。