张华述，蒋 勋，张瑞娜，廖 琅，刘国祥，邹宇航，王 俊，燕思凡，范静苑，李晓旭，钟 秋*，张兴伟*

1.四川省烟草公司德阳市公司，四川省德阳市旌阳区长江东路176号 618400

2.中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经4路11号 266101

3.四川中烟工业有限责任公司长城雪茄烟厂，四川省德阳市什邡市经济开发区蓥华山路南段128号 618499

4.湖南中烟工业有限责任公司，长沙市劳动中路386号 410007

雪茄烟为全烟叶构成的圆或方柱形烟支，是一种特殊的烟草制品。近年来，雪茄烟吸引了越来越多的消费者，国内外市场需求日益增长，产业前景广阔［1］。然而，我国雪茄烟叶研究工作起步晚，基础研究相对落后，目前种植的品种绝大部分为国外品种或地方晾晒烟品种［2-4］。四川是我国著名的雪茄烟叶种植地，其中国外引进品种德雪1号、德雪2号、德雪3号及地方晒烟什烟一号在该地区广泛栽植。由于该地种植品种较为单一且主栽品种退化，雪茄烟叶产业的发展受到制约［5］。因此，雪茄烟叶种质资源的遗传分析对四川地区后期种质资源的开发利用、现有主栽品种的改良及新品种的选育等至关重要。

仅依靠田间农艺性状进行种质资源遗传分析的工作量大、成本高且准确性低，而分子标记技术可大大提高遗传分析的准确性和效率。简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）广泛分布于真核生物基因组中。SSR分子标记具有多态性高、检测成本低廉及稳定性好等特点。Bindler等［6］构建第一张烟草SSR分子标记遗传连锁图谱后，SSR分子标记广泛应用于烤烟［7］、晾晒烟［8］及香料烟［9］的种质资源遗传分析。此外，基于SSR分子标记的雪茄烟叶遗传分析也有少量研究，王琰琰等［10］通过14个SSR分子标记对220份雪茄烟叶种质进行指纹图谱构建；向小华等［11］基于SSR分子标记技术对海南雪茄烟叶种质资源进行遗传多样性分析。但目前针对四川地区雪茄烟叶种质资源的遗传分析还鲜见报道。为此，基于农艺性状和SSR分子标记对20份国内外雪茄烟叶著名产地的种质资源进行了系统遗传多样性分析，以期确定四川雪茄烟叶种质资源的遗传背景，为其后续的鉴定、保存、开发和利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为20份雪茄烟叶种质资源，均来自四川省烟草公司德阳市公司，具体信息见表1。参试品种连续3年（2019—2021）种植于四川省什邡市洛阳村试验田。试验为完全随机设计，采用当地常规管理方法进行田间管理。移栽期为每年4月下旬，设3次重复，每个重复种植1行，每行20株，株行距40 cm×110 cm，施纯氮9.5 kg/666.7 m2。

表1 供试雪茄烟叶种质资源信息Tab.1 Information of cigar tobacco germplasm resources

1.2 性状调查

在各种质中心花开放期进行农艺性状调查。农艺性状包括叶长、叶宽、叶片数、叶片厚薄、株高、茎围、节距、支脉粗细、主脉粗细、支脉数、主侧脉夹角和茎叶夹角。田间性状调查按照《烟草种质资源描述规范和数据标准》［12］进行。

1.3 基因组DNA的提取

取团棵期幼嫩叶片置于2 mL离心管（山东思科捷生物技术公司）中并快速放入液氮中冷冻，带回实验室后利用SLS法提取DNA［10］，加ddH2O在4℃条件下溶解12 h。将DNA浓度统一稀释到50 ng/μL，-20℃低温保存。

1.4 SSR引物

利用6个雪茄烟叶品种（Little Dutch、H211、Beinhart1000-1、Hicks、Havana10、H382）对Bingler等［6］公布的2 317对SSR引物进行初步筛选（图1），最终获得43对多态性好、条带清晰的引物（表6），由六合华大（北京）基因科技有限公司合成。

图1 SSR引物（部分）的筛选Fig.1 Screening of SSR primers（Partial）

1.5 PCR扩增

使用PCR仪（LS-TP96，美国LabSERV公司）对提取的样本DNA进行PCR扩增。PCR反应总体系为10μL（DNA 1μL，2×Taq Master Mix 5μL，ddH2O 2μL，上、下游引物各1μL）。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，35个循环；72℃延伸8 min。使用质量分数8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增得到的PCR产物。

1.6 数据分析

1.6.1 农艺性状

使用Microsoft Excel计算各数量性状的最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数和多样性指数。遗传多样性指数计算采用Shannon Wiener信息指数，计算公式：H′=-∑Piln Pi（i=1，2，…，n）。式中：Pi为某性状第i个级别出现的概率［13］。利用Origin 9.1进行主成分分析和聚类分析［14］。将调查数据作标准正态变换，聚类方法采用组内连接法，以欧氏距离绘制聚类树状图。

1.6.2 SSR标记

用DataFormater软件将读取的“0、1”数据进行矩阵转换；用MEGA 7.0.21软件进行聚类分析，采用非加权组平均法（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）；利 用NTSYS-pc 2.10软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）；利用Structure 2.3.4软件进行群体遗传结构分析［10］。

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶种质资源的表型鉴定及遗传多样性分析

2.1.1 雪茄烟叶种质资源农艺性状的多样性分析

不同年份20份雪茄烟叶种质资源12个农艺性状的表型数据的均值和标准差无显著差异，表型数据的环境误差较低（表2）。各农艺性状的变异系数在6.59%~19.97%之间，遗传多样性指数在1.69～2.18之间（表3）。表型的平均变异系数为10.10，其中叶数的变异系数最高，达19.97%；其次为株高，为13.70%。支脉数的变异系数最低，为6.59%；其次是主侧脉夹角，为6.74%。表型的平均遗传多样性指数为2.03，其中株高的遗传多样性指数最高，达2.18；其次为主脉粗细，为2.15。叶长的遗传多样性指数最低，为1.69；其次是茎叶夹角，为1.85。表明参试的雪茄烟叶种质资源具有较丰富的表型变异。

表3 雪茄烟叶种质资源数量性状遗传多样性分析Tab.3 Genetic diversity analysis of quantitative traits of cigar tobacco germplasm resources

2.1.2 雪茄烟叶重要农艺性状的主成分分析

利用Origin 9.1对供试种质的12个农艺性状进行主成分分析（表4），主要信息集中在前5个主成分中，累计贡献率为83.55%。第1主成分的特征值为3.427，贡献率为28.56%，主要因素是主脉粗细、支脉粗细、茎围、叶长等烟叶外观品质性状，其特征向量分别为0.431、0.404、0.367和0.357。第2主成分的特征值为2.596，贡献率为21.63%，主要因素是叶片厚薄、株高和支脉数等雪茄烟叶产量和外观品质性状，其特征向量分别为0.472、0.439和0.422。第3主成分的特征值为2.102，贡献率为17.51%，主要因素是节距、叶长和叶数等与产量相关的性状，其特征向量分别为0.410、0.399和0.367。第4主成分的特征值为1.054，贡献率为8.78%，主要因素是茎叶夹角，该性状与株型相关。第5主成分的特征值为0.848，贡献率为7.07%，主要因素是主侧脉夹角、叶片厚薄等外观品质性状。根据各性状的特征值和贡献率的大小，认为株高、茎围、叶长、茎叶夹角、支脉粗细、主脉粗细和支脉数是造成供试雪茄烟叶种质资源表型差异的主要因素，可为今后雪茄烟叶育种中资源鉴定评价和亲本选择提供借鉴。

表4 农艺性状的主成分分析Tab.4 Principal component analysis of agronomic traits

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2.1.3 基于农艺性状的雪茄烟叶种质资源聚类分析

基于12项农艺性状对20份雪茄烟叶种质资源进行聚类分析，遗传距离为30时，分为4个类群（图2）。各类群的农艺性状进行统计（表5）的结果表明，各大类群的雪茄烟叶种质资源的农艺性状具有显著差异。第Ⅰ类群包含5份资源，有德雪1号、德雪2号、德雪3号、哈珀纳斯和Cubra-Brazil。该类群种质的表型特征为：烟株较高，叶数较多，叶片短薄，主侧脉夹角最小且主脉细。其中主侧脉夹角变异系数最低，主脉粗细和支脉数的变异系数较高。第Ⅱ类群包含3份资源，有C-15、多米尼加长芯和多米尼加短芯。该类群种质的表型特征为：烟株高，叶数多，叶片窄薄，主侧脉夹角较大且支脉数多。其中株高、茎围、叶数、叶长、叶宽和主脉粗细的变异系数较低，主侧脉夹角的变异系数最高。第Ⅲ类群包含7份资源，有Habana92、OLOR、CP2011、MSCA、MNC、CS0708和3763。该类群种质的表型特征为：茎细，叶数最少，叶窄长，主侧脉夹角大，茎叶夹角大且支脉细。其中节距的变异系数最高，支脉粗细和支脉数的变异系数较低。第Ⅳ类群包含5份资源，有什烟一号、美国康州阔叶、MFPP、MFZS和尼加拉瓜长芯。该类群种质的烟株较矮，叶数较少，茎叶夹角小，叶片厚且主支脉粗。其中株高、茎围、叶数、叶长和支脉粗细的变异系数较大，叶片厚薄的变异系数最低。

图2 基于农艺性状的雪茄烟叶种质资源聚类图Fig.2 Cluster map of cigar tobacco germplasm resources based on agronomic traits

表5 各类群雪茄烟叶种质的农艺性状特征Tab.5 Agronomic traits of cigar tobacco germplasm in different groups

2.2 基于SSR的雪茄烟叶种质资源遗传多样性分析

2.2.1 主成分分析

43对SSR引物在20份种质资源中共检测出247个基因位点（表6）。同时，检测到等位基因数为2~13个，平均5.65个，其中PT52689的最多，PT52176的最少，具体基因型信息见表6。

表6 SSR分子标记信息表Tab.6 Information of SSR markers

主成分分析的二维图将供试种质划分为3个类群（图3），类群Ⅰ包括德雪1号、多米尼加短芯和C-15等7份种质，类群Ⅱ包括CS0708、尼加拉瓜长芯和OLOR等8份种质，类群Ⅲ包括哈伯纳斯、美国康州阔叶、CP2011和MFZS共4份种质。另外，中国四川的德雪1号、德雪2号和德雪3号均属于类群Ⅰ，而什烟一号则是离群样本。

图3 基于SSR标记的雪茄烟叶种质资源主成分分析Fig.3 Principal component analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

2.2.2 聚类分析

UPGMA聚类法可以很好地区分供试种质资源，在遗传距离为0.3处将20份种质聚类成4个类群（图4），类群Ⅰ包含德雪1号、德雪2号、德雪3号、C-15和多米尼加长芯等11份种质；类群Ⅱ包含OLOR、CP2011、MFPP、MSCA和MNC共5份种质；类群Ⅲ包含3763和MFZS共2份种质；类群Ⅳ包含什烟一号和CS0708共2份种质。聚类分析结果和主成分分析结果虽存在一定差异，但2次分析中，中国四川的德雪1号、德雪2号和德雪3号与C-15、多米尼加长芯和多米尼加短芯均聚类至同一类群，说明它们之间有较高的遗传相似度。

图4 基于SSR标记的雪茄烟叶种质资源聚类分析Fig.4 Cluster analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

2.2.3 遗传结构分析

利用Structure软件对供试的雪茄烟叶种质进行群体遗传结构分析，由ΔK（似然值）确定最优分群数K值，当K=3时似然值最大（图5a），因此将供试种质划分为3个类群。类群Ⅰ包含MNC、MSCA和MFPP；类群Ⅱ包含多米尼加长芯、多米尼加短芯、什烟一号和3763等10份种质；类群Ⅲ包含德雪1号、尼加拉瓜长芯和C-15等7份种质。其中，四川的德雪1号、德雪2号和德雪3号再次与古巴种质C-15聚类至同一类群，说明这4个种质具有很高的遗传相似度。

图5 基于SSR标记的雪茄烟叶种质资源遗传结构分析Fig.5 Genetic structural analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

3 讨论

3.1 基于农艺性状的雪茄烟叶种质资源遗传多样性分析

20份雪茄烟叶种质资源农艺性状的遗传多样性的分析结果表明，供试的雪茄烟叶种质资源具有丰富的表型多样性，资源的可利用范围较大。同时根据12个农艺性状将供试种质资源聚类为4大类群。根据各类群的表型特征，第Ⅰ类群可作为选育高产茄衣品种的候选群体，且德雪1号、德雪2号和德雪3号这3个品种均分布其中；第Ⅱ类群可作为高产茄芯品种的候选群体；第Ⅲ类群可作为优质茄衣品种的候选群体；第Ⅳ类群可作为优质茄芯品种的候选群体。12个农艺性状的主成分分析结果表明，前5个主成分的累计贡献率达83.55%。因此，在雪茄烟叶的品种改良和新品种选育时，需综合考虑品种农艺性状间的相互关系［15］。

3.2 基于SSR标记的雪茄烟叶种质资源遗传多样性分析

20份雪茄烟叶种质资源的主成分分析、聚类分析和遗传结构分析结果存在一定差异，主成分分析和遗传结构分析将供试种质分为3大类群，聚类分析把供试种质分为4大类群。主成分分析的类群Ⅰ和类群Ⅱ包含于聚类分析的类群Ⅰ中，遗传结构分析的类群Ⅰ包含于聚类分析的类群Ⅱ中。该差异可能是因为供试群体较小，并且各种聚类方法的依据不同［16］（主成分分析基于遗传相似度系数，聚类分析基于遗传距离，遗传群体结构分析则基于等位基因频率差异），从而导致不同方法得到的结果存在差异。但3种分析方法的结果均与地理来源相关，且四川的德雪1号、德雪2号和德雪3号多次被聚类至同一类群。多米尼加长芯和多米尼加短芯多次被聚类至在同一类群，这与向小华等［11］的研究结果一致。同时，基于SSR标记的遗传多样性分析结果和基于农艺性状的聚类分析结果相似，说明本研究中对供试种质的遗传多样性分析较准确，可为种质资源的开发利用和新品种的选育提供参考。

3.3 四川雪茄烟叶溯源

供试的雪茄烟叶种质资源虽仅有20份，但大多来自古巴、美国、多米尼加等世界著名雪茄烟叶产地，具有很高的地区代表性和研究潜力。供试雪茄烟叶种质资源的农艺性状聚类分析结果表明，德雪1号、德雪2号和德雪3号这3个品种在农艺性状上具有很高的遗传相似度。同时，基于SSR标记的主成分分析、聚类分析和遗传结构分析的结果均表明，德雪1号、德雪2号和德雪3号与古巴的C-15属于同一类群，并与多米尼加长芯、多米尼加短芯也有较高的遗传相似度，与王琰琰等［10］的研究结果基本一致，这也为德雪系列的溯源研究提供重要线索。此外，什烟一号是具雪茄风味的本土晒烟品种，于明朝末年自东南亚引入中国四川什邡［17］。由于长期的地理隔离，什烟一号与其他参试种质资源的亲缘关系较远，因此什烟一号在SSR标记的主成分分析中成为离群样本。确定德雪1号、德雪2号、德雪3号和什烟一号4个四川雪茄烟叶主栽品种的遗传背景，可为其品种改良提供参考。

4 结论

对四川德阳烟草公司收集的20份雪茄烟叶种质资源进行的遗传多样性分析发现，供试种质农艺性状的平均遗传多样性指数为2.03，平均变异系数为10.10，表型变异丰富。基于农艺性状的群体结构分析和基于SSR标记的群体结构分析结果基本一致，且分析结果均与地理来源相关。确定了四川雪茄烟叶种质资源的遗传背景，德雪1号、德雪2号和德雪3号与古巴品种C-15有较高的亲缘关系，为其主栽品种改良和新品种选育提供了较好的理论基础。