周圣曜, 赵新军, 2

(1. 伊犁师范大学 新疆凝聚态相变与微结构实验室， 伊宁 835000; 2. 伊犁师范大学 微纳电传感器技术与仿生器械实验室， 伊宁 835000)

1 引 言

代谢重编程被认为是癌症的标志[1]，近来的研究发现[2-4]，在人类肿瘤细胞中存在异常的糖原含量，表明了异常的葡萄糖代谢. 在癌症的发生发展途径中，葡萄糖和谷氨酰胺代谢通过 MYC、P53、Ras 相关癌基因、LKB1-AMP激酶(AMPK)和PI3激酶(PI3K)在信号通路中的突变而重新编程，其中，致癌的Ras既可以通过增强 GLUT1 蛋白的表达来刺激葡萄糖的摄取，又可以通过合成代谢途径来利用葡萄糖[5,6]，因此，葡萄糖代谢异常已成为癌症的重要标志之一. 糖原是葡萄糖的分支聚合物，储存在肌肉和肝脏中，在需要时用作能量供应[7]. 糖原合酶(GS)是糖原合成中的限速酶[8]，在哺乳动物中，有两种亚型：由 GYS1 编码的肌肉 GS 和由 GYS2 编码的肝脏限制性同工型[8,9]. GYS1 在脂肪、心脏和肌肉中广泛表达，而 GYS2 则主要在肝脏中表达[10,11]. 病理学研究表明[12]，GYS2 缺乏会导致糖原贮积病0型(GSD-0)并伴有葡萄糖耐量降低的症状. 肝脏在糖原代谢过程中，GYS2 被糖原合酶激酶3(GSK3) 磷酸化和抑制，激活 GSK3 可以促进 GYS2 磷酸化和失活，蛋白磷酸酶1(PP1)则催化 GYS2 去磷酸化并激活[13,14]. 在昼夜节律基因(CLOCK)的调控作用下，GYS2 的活性表现出磷酸化/去磷酸化昼夜节律的转变，这样，GYS2 的表达合成呈现出了昼夜节律性[15,16]. 以往的研究发现[17-19]，胰岛素(Insulin)可以刺激 GSK3 磷酸化抑制其活性，通过依赖PI3K激酶的途径，胰岛素激活 AKT 激酶，经过 AKT 的催化作用，促进了 GSK3 磷酸化和失活[20]. 这样，胰岛素通过 GSK3 对 GYS2 的活性进行调节，有助于实现昼夜节律的肝糖原合成，从而成为 GYS2 激活表达、维持血糖在合理范围内的基础. 因此，CLOCK 基因的突变、以及胰岛素合成异常将会导致 GYS2 活性的昼夜节律行为改变，进而导致葡萄糖代谢紊乱，促进肝癌(HCC)的发生发展. 最近 Kumagai 等人[21]通过基因组分析表明，癌细胞中的RHOA基因突变激活了PI3K-AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导途径，增加了游离脂肪酸的产生，促进了肿瘤的进展. mTOR 是一种进化保守的 Ser/Thr 激酶，与多种生理过程和病理状态有关，并且 mTOR 通过激活 S6K(p70 S6 激酶)，限制 GSK3 的活性，从而在一定程度上改变 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变特性，影响糖原昼夜节律的合成，促使 HCC 细胞的生长增殖[22,23].

在癌细胞的生长增殖过程中，P53 蛋白是最重要的癌变抑制因子之一[24]. 在响应应激信号过程中，P53 介导细胞对 DNA 损伤、致癌性侵害做出反应，引发细胞暂时的细胞周期停滞、永久性细胞衰老和凋亡性细胞死亡，以防受损或受压的细胞继续增殖. 在抑制癌细胞增殖过程中，P53 诱导 MDM2 和 PTEN转录，MDM2 通过抑制 P53 的反式激活活性来抑制 P53 的功能[25]，而 PTEN 使 PIP3 去磷酸化以抑制 AKT 激活[26]. AKT 可以通过 MDM2 调节 P53 的表达水平诱导细胞凋亡，即形成 AKT-MDM2-P53-PTEN 反馈回路，并且 MDM2 还可与 GYS2 直接结合，以抑制 P53 的泛素化[27]. 这样 P53 通过抑制 AKT，还可以重塑癌细胞的糖原代谢与应激代谢异常，从而有利于细胞癌变的抑制. 因此，在 HCC 进展过程的微环境中，AKT 的激活表达，对 GSK3 介导的胰岛素调节 GYS2 的表达合成，以及 P53 启动癌变抑制程序至关重要.

鉴于文献[20,21,22,25,27]中新颖而重要的实验结果，可以得出：通过 AKT 的调节作用，胰岛素与 P53 可以实现 GSK3 的调控，从而进一步调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化的昼夜节律转变特性. 糖原代谢的规律性不仅与昼夜节律的基因 (例如CLOCK 基因)密切相关，而且胰岛素与 P53 也会在很大程度上调节糖原代谢的昼夜节律性. 一系列实验研究结果已经表明[5,28,29]，癌症的发生发展与昼夜节律代谢紊乱之间存在联系，深刻理解胰岛素与 P53 如何改变 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，对于设计阻止 HCC 发生发展的治疗方案是非常重要的. 实验的结果[25-27,30,31]确认了胰岛素与 P53 对糖原代谢的调节作用，但是对于胰岛素与 P53 调节糖原代谢的物理机制，以及信号路径却没有研究清楚. 之前的理论[32-35]在激活基因通路研究方面已经取得了重要的成果，并定量揭示了肿瘤抑制的物理机理. 但是在 HCC 进展过程的微环境中，胰岛素与 P53如何通过调节 GSK3，调控糖原代谢的作用机制仍然未知.

在本文中，将建立动力学理论模型，研究在 HCC 进展过程的微环境中， GSK3介导的胰岛素与 P53对糖原代谢的调控作用. 分析胰岛素激活 PI3K-AKT-mTOR 信号传导途径调控 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，以及 P53 通过 AKT-MDM2-P53-PTEN 信号通路，对 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性的调节特性. 进一步深刻揭示 GSK3 介导的胰岛素、P53调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化的转变特性，为设计阻断 HCC 发生发展的通路治疗方案提供理论依据.

2 理论模型

图 1 胰岛素、P53调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变通路的具体模型示意图(模型图中 b 图为 a 图中 PD 模块部分).Fig.1 Schematic depiction of the model on insulin and P53 regulating the phosphorylation/dephosphorylation transition pathway of GYS2( Fig.b in the model diagram is the PD module of Fig.a).

GSK3 介导的胰岛素、P53 调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的模型如图1所示. 在这里我们考虑：胰岛素通过激活 PI3K-AKT-mTOR 信号途径中的 AKT 抑制 GSK3，影响 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变，以及 P53 诱导 MDM2 和 PTEN 转录，MDM2 反抑制 P53，形成 AKT-MDM2-P53-PTEN 反馈回路[26,27]. MDM2 和 GYS2 直接结合抑制 GYS2 的表达，未与MDM2 结合的 GYS2(FGYS2) 活性呈现出昼夜节律的特性，CLOCK 基因通过调控昼夜节律mRNA(Circadian mRNA)和频率蛋白质(FRQ)的合成表达，调节 FGYS2 磷酸化/去磷酸化，FGYS2 被 GSK3 磷酸化抑制其活性，而被 PP1 去磷酸化激活[14].

假定 MDM2 和 GYS2 的直接结合形成复合体 MMG 的反应为二级反应，昼夜节律 mRNA标记为 Circadian mRNA(CmRNA). 基于 Hill 动力学与 Michaelis-Menten 方程[36,37]，可以获得各组分浓度随时间演化的动力学方程组为：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

[MGYS2]=k10[GYS2]

(10)

[FGYS2]=k11[GYS2]

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

以上方程组中，k10、k11为竞争因子参数，为了符合实验结果[18,20,21,22,25,27]，我们模型化k10=1/{1+exp[0.5(1-[MDM2]/[GYS2])]}，描述 MDM2 对 GYS2 的结合能力，k11=1-k10，标记未与 MDM2 结合的 GYS2 的分数. 与 MDM2 结合的 GYS2 标记为 MGYS2，未与 MDM2 结合的 GYS2 标记为 FGYS2. 描述 GYS2 的磷酸化状态标记为 FGYS2 的超磷酸化态(pGYS2)，GYS2 去磷酸化状态为 FGYS2 低磷酸化态(dGYS2)，dGYS2 激活CmRNA. pGYS2 与 dGYS2 间的转换，明确了 GYS2 磷酸化/去磷酸化的转变特性. 方程组中 [FGYS2]=[pGYS2]+[dGYS2]，Hill 系数为n1=5、n2=3、n3=5.

生物系统具有很强的稳定性，这使得合理的数学模型能够在较大的参数范围内有效描述系统的特性，可以通过考察模型对参数变化的敏感性检测参数(表1)设置的合理性，模型中微分方程组可以通过四阶变步长Runge-Kutta 方法求解.

3 结果与讨论

胰岛素在刺激糖原合成过程中，通过 PI3K 激酶激活 AKT，经过 AKT催化抑制 GSK3 的活性[18]，进而影响 GYS2 磷酸化/去磷酸化的转变. 为了考察GSK3 介导的胰岛素对 GYS2 的抑制调节，可以首先考察 [AKT] 随时间演化的动力学特性.

图2呈现了在不同胰岛素浓度条件下，[AKT]

附1 模型中的参数取值

随时间演变的动力学关系. 从图 2 可以看出，AKT 浓度随时间的演化而逐渐增大，升高到了较大的稳定值，这表明 AKT 被激活并达到一定的表达水平. 比较不同胰岛素浓度时的 [AKT]，可以看出，随着 [Insulin] 增大，[AKT] 随时间演化的稳定幅值变大(图4a). 由此表明了胰岛素在 PI3K-AKT-mTOR 信号传导中的作用. 胰岛素通过激活并提升 AKT 的表达水平上调，从而进一步激活下游通路信号. 在胰岛素刺激糖原合成过程中，通过刺激 PI3K 激酶的途径，胰岛素激活 AKT，并且较大浓度的胰岛素在很大程度上提升了 AKT 的表达水平，经过 AKT 的催化作用，抑制 GSK3 激酶的活性[16-18].

图 2 不同 [Insulin] 条件下，[AKT] 随时间演变的动力学关系.Fig.2 Temporal evolutions of the level of [AKT] at different [Insulin].

图 3 不同[Insulin] 条件下，[GSK3] 随时间演变的动力学关系.Fig.3 Temporal evolutions of the level of [GSK3] at different [Insulin].

图 3 显示了不同 [Insulin] 条件下，[GSK3] 随时间演变的动力学关系. 从图 3 可以看出，随着时间的演化，[GSK3] 极快地升高到了最大值，然后持续短时间后急剧降低并趋于稳定值不变. 由此表明，[GSK3] 随时间演化的初始阶段呈现了脉冲式的激活表达，进而触发增强了 GYS2 的磷酸化和抑制. 实验研究表明[17,18]， GYS2 被 GSK3 磷酸化和抑制，磷酸化的 GYS2 处于失活状态，不利于糖原合成. 随着 [Insulin] 增加，图 3 也显示了 [GSK3] 随时间演化的幅值减小，由此表明了胰岛素对 GSK3 的抑制作用. 胰岛素激活 AKT，较大浓度的胰岛素会使得 AKT 的表达水平上调，由于 AKT 对 GSK3 的抑制效应，致使在较大胰岛素浓度条件下，GSK3 呈现了较低的激活表达水平. 这样会使得 GSK3 对 GYS2 的磷酸化和抑制性减弱，促进了 GYS2 去磷酸化并激活，有利于糖原合成. 另外，胰岛素还通过 PI3K-AKT-mTOR-S6K 通路对 GSK3 形成负反馈，抑制减弱 GSK3 的表达水平，刺激糖原合成. 由此可见，胰岛素通过激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信号通路，通过抑制 GSK3 调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化，进而调控葡萄糖的代谢. 为了进一步确定胰岛素调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化效应，可以考察不同胰岛素浓度条件下，dGYS2 随时间的演化特性.

图 4 不同[Insulin] 条件下 [dGYS2]随时间演变的动力学关系.Fig.4 Temporal evolutions of the level of [dGYS2] at different [Insulin].

图 4 呈现了在不同胰岛素浓度条件下，dGYS2 浓度随时间演变的动力学关系. 从图 4 可以看出，在胰岛素浓度适当的条件下(50 nM)，[dGYS2] 显示了较为稳定的随时间周期演化振荡特性，稳定振荡周期约为 24 h，这与 Doi 等人的染色质免疫沉淀分析测量实验结果一致[16]. 由此表明，在一个昼夜周期中，GYS2 去磷酸化激活保持了很好的节奏感，调控着 GYS2 活性的昼夜节律表达. 这样，通过 GYS2 去磷酸化激活的昼夜节律性，调节肝糖原昼夜节律的合成. Doi 等人的实验表明[15]，CLOCK 基因通过调控 CmRNA 和 FRQ 的合成表达，在 GSK3 激酶和 PP1 激酶的作用下，调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化的昼夜节律性表达[14,16]. 在这里我们发现，在胰岛素浓度适当的条件下，dGYS2 正常的周期演化振荡特性被很好地保持，由此表明，适当的胰岛素浓度，有助于 CLOCK 基因调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化的昼夜节律性表达，维持正常的糖原代谢. 在较低胰岛素浓度条件下(1～50 nM)，随着胰岛素浓度降低，dGYS2 随时间演变的周期性开始变大(图4a)，进一步降低胰岛素浓度(～1nM)，dGYS2 随时间演化的周期几乎完全改变，并且振荡规律演化为极短的脉冲式信号，振荡幅度增加. 由此表明，在胰岛素浓度太低的情况下，GYS2 去磷酸化激活的昼夜节律性会被改变，进而改变了肝糖原昼夜节律的合成规律，导致肝脏内糖原代谢周期异常；dGYS2 振荡幅度增加则表明糖原代谢活性增强，出现血糖升高症状. 在较高胰岛素浓度条件下(50～250 nM)，随着胰岛素浓度增大，如图 4b 所示，dGYS2 随时间改变的周期演化振荡性开始改变，当胰岛素浓度较高时(～250 nM)，随着时间演化，dGYS2 的周期振荡性逐渐消失，周期性规律被完全改变，振幅降低. 由此表明，在胰岛素浓度太大的情况下，GYS2 去磷酸化激活的昼夜节律性会被极大地改变，肝糖原昼夜节律的合成规律被破坏，进而导致肝脏内糖原代谢异常降低.

由于胰岛素通过激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信号通路，激活 AKT 抑制调节 GSK3 的表达水平，GSK3 催化 GYS2 磷酸化，同时，PP1 促进 GYS2 去磷酸化，在 CLOCK 基因、FQR 蛋白以及适当浓度胰岛素的调节作用下，体系始终处在 GYS2 磷酸化/去磷酸化昼夜节律转变的动态平衡中，维持昼夜节律的糖原代谢. 然而，较少的胰岛素不足以抑制 GSK3，这样 GSK3 活性较大地增强，过多地促使 GYS2 磷酸化，导致糖原代谢异常. 较多的胰岛素则会过量地抑制 GSK3，使得 GSK3 活性较大程度地降低，对 GYS2 磷酸化的催化能力减弱，致使 PP1 催化的 dGYS2 不能被及时磷酸化，进而导致糖原代谢紊乱.

Boroughs 等人的研究发现[1]，在糖原代谢存在异常时，P53 具有促进代谢适应的调控作用，通过 P53 调控，异常的代谢会被调节，帮助平衡糖酵解和磷酸化，并有助于细胞适应和抵抗代谢应激. 为了进一步明确 P53 对糖原代谢异常的调节作用，可以考察在较低和较高胰岛素浓度条件下，P53 对 dGYS2 异常的昼夜节律性演变的调节恢复特性.

图 5 [Insulin]=1 nM(a) 与[Insulin]=250 nM(b) 时，[dGYS2]随时间演变的动力学关系Fig.5 Temporal evolutions of the level of [dGYS2] for [Insulin]=1 nM(a) and [Insulin]=250 nM(b).

图 5 呈现了在 [Insulin]=1 nM 与 [Insulin]=250 nM 时不同k5条件下，dGYS2 随时间演变的动力学关系.k5参数描述了 P53 的生成速率，较大的k5参数，表明了 P53 较快的生成速率，对应着 P53 随时间演化的较大的幅值与其较高的表达水平. 从图 5 可以看出，通过改变k5参数，在较低(图5a)和较高(图5b)胰岛素浓度条件下 dGYS2 异常的昼夜节律性，可以被调节恢复. 由此表明，P53 对较低和较高胰岛素浓度条件下 dGYS2 昼夜节律性的异常，有明显的调节恢复作用，随着 P53 的增多或降低，昼夜节律的周期性逐渐被还原. 这是由于，胰岛素通过激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信号通路，激活 AKT 抑制调节 GSK3 的表达水平，P53 则会通过 AKT-MDM2-P53-PTEN 回路抑制 AKT，这样，胰岛素合成异常导致的 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律改变，可以通过激活 P53 的表达水平进行合理地调节恢复. 另外，在 P53 的作用下，会有较多的 MDM2 激活，MDM2 和 GYS2 的直接结合减少了 FGYS2 的表达水平，在一定程度上也调控了 GYS2 磷酸化/去磷酸化的表达水平和昼夜节律特性.

图 6 不同 k5 条件下，[GSK3] 与 [FGYS2] 随时间演变的动力学关系.Fig. 6 Temporal evolutions of the levels of [GSK3] and [FGYS2] at different k5.

图 6 显示了不同k5参数条件下，[GSK3] 与 [FGYS2] 随时间演变的动力学关系. 从图 6a 可以看出. 在一定的k5参数变化范围内，随着 P53 表达水平的提升，[GSK3] 去磷酸化激活在一定程度上被增强. 这意味着较高的 P53 表达水平，会减弱胰岛素对 GSK3 的抑制程度，使得 GSK3 活性增强. 这是由于，通过 AKT-MDM2-P53-PTEN 回路，P53 抑制 AKT，减弱了胰岛素对 GSK3 的抑制. 此外，P53 较高的表达水平，会激活较多的 MDM2，这样与 MDM2 结合的 GYS2 增多，减少了 FGYS2 的表达水平. 图 6 还显示了较大k5参数，对应着较小的 [FGYS2] 随时间演变的幅值. 由此表明了 P53 的增多，在一定程度上可以调低 FGYS2 的幅值水平，进而影响改变 GYS2 的活性，以及磷酸化/去磷酸化的昼夜节律性. 这样，P53 通过调控胰岛素对 GSK3 的抑制程度，以及 FGYS2 的表达水平，实现了调节恢复 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，进而调节恢复异常的糖原代谢，帮助细胞适应和抵抗代谢异常应激[38].

4 结 语

在本文中，基于Hill 动力学与 Michaelis-Menten 方程，建立理论模型研究 HCC 进展过程的微环境中，GSK3 介导的胰岛素对糖原代谢的调节作用，以及 P53 调节恢复异常的糖原代谢. 分析了胰岛素激活 PI3K-AKT-mTOR 信号传导途径，调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，以及 P53 通过 AKT-MDM2-P53-PTEN 信号通路，对 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律异常的调节恢复特性. 研究发现，胰岛素通过激活并提升 AKT 的表达水平，经过 AKT 的催化作用，GSK3 随时间演化呈现了脉冲式的激活表达，进而触发增强了 GYS2 的磷酸化和抑制作用. 由此表明，胰岛素通过激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信号通路，在一定程度上调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化. 通过考察不同胰岛素浓度条件下，dGYS2 随时间的演化特性，我们发现，随着胰岛素浓度降低，dGYS2 随时间演变的周期性改变. 由此表明，在胰岛素浓度太低的情况下，GYS2 去磷酸化的激活的昼夜节律性会被改变，进而改变了肝糖原昼夜节律的合成规律. 在较高胰岛素浓度条件下，随着胰岛素浓度增大，dGYS2 随时间演变的周期演化振荡性会被极大地改变，肝糖原昼夜节律的合成规律被破坏. 通过考察在较低和较高胰岛素浓度条件下，P53 对 dGYS2 异常的昼夜节律性演变的调节恢复特性，我们发现在 P53 作用下，原本紊乱的 dGYS 随时间的演化，随着 P53 的增多或降低，昼夜节律的周期性逐渐被还原. 由此表明，P53 调节恢复 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，进而调节恢复异常的糖原代谢.

本文中只考虑胰岛素与 P53 协同通过激活、抑制 AKT 调节 GSK3 活性，从而改变糖原代谢特性. 事实上，胰岛素还可以通过抑制GSK3刺激起始因子2B(eIF2B)的去磷酸化和激活，促进蛋白质合成的速率改变[39,40]. GSK3 还催化真核蛋白合成 eIF2B 的磷酸化和抑制，从而抑制蛋白合成. 因此，胰岛素在人类代谢调节中的生物功能仍需要进一步研究[41]. 本文考虑胰岛素激活PI3K-AKT-mTOR 信号传导途径，调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，以及 P53 通过 AKT-MDM2-P53-PTEN 信号通路，调节恢复 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性，进而调节糖原代谢. 理论结果符合实验[18,20-22,25]，进一步揭示了 GSK3 介导的胰岛素调节 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变的昼夜节律性的调节机理，以及 P53 对 GYS2 磷酸化/去磷酸化转变异常的调节恢复特性，可为设计阻断 HCC 发生发展的通路治疗方案提供理论依据.