胡晓蕾 尧银光 刘素霞

原发性肝癌（HCC）是常见恶性肿瘤，据统计全球每年新发病例超过100万例，其中我国约占40%，在所有恶性肿瘤发病率中占第3位［1］。肝动脉化疗栓塞术（TACE）是目前应用最广泛的肝癌治疗方式之一，也是巴塞罗那分期推荐的中期肝癌标准治疗方式，亦用于无法行治愈性治疗的早期肝癌［2］。但是，单纯TACE有肿瘤坏死不完全、易复发、加重肝功能损害等局限性，影响患者的远期生存率。这与肝癌患者出现的机体抗肿瘤免疫缺陷，尤其是细胞免疫功能抑制密切相关［3］。本研究拟通过对HCC患者术后外周血免疫细胞组进行检测，了解患者术后细胞免疫功能的变化，为检测患者术后的免疫指标选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年7月至2016年3月本院行TACE治疗的HCC患者36例，男30例，女6例；年龄28～86岁。诊断符合《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》诊断标准［4］。排除标准：孕妇及哺乳期妇女；合并其他噬肝病毒感染及有重要器官疾病者（严重心、肾、甲状腺疾病，糖尿病，精神病等），近6个月接受干扰素抗病毒及免疫调节或免疫抑制药物治疗者。

1.2 主要试剂和仪器 荧光标记的鼠抗人单克隆抗体 CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3PC5，CD11b FITC、CD15 RD1、CD14 PC5、CD45 PC7，CD4 PC7、CD127RD1、CD25 FITC、CD45 PC5，溶血素、鞘液、清洗液，BECKMAN COULTER Cytomics FC500 MCL型流式细胞仪均购自美国贝克曼库尔特公司。

1.3 外周血细胞免疫表型检测 （1）标本采集：分别于行化疗栓塞术前24 h内和术后72～96 h内取外周静脉血2 mL，置EDTA抗凝管，于6 h内检测。（2）T淋巴细胞亚群检测：于流式管中加入单克隆抗体（CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5）10 μL，加入 100 mL血液，混匀后室温避光温育15 min。再加入0.5 mL溶血素混匀，避光温育10 min后加0.5 mL鞘液上流式细胞仪检测。（3）CD45modCD11b+CD14-CD15-细胞的检测：于流式管中加入单克隆抗体CD11b FITC和CD15 RD1 20 μL，CD14 PC5 和 CD45 PC7 10 μL，加入100 μL血液，混匀后室温避光温育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解红细胞，避光温育10 min后，用鞘液洗涤1次，加0.5 mL鞘液上流式细胞仪检测。（4）调节性T细胞（Treg）的检测：于流式管中加入单克隆抗体（CD4 PC7、CD127RD1、CD45 PC5各10 μL，CD25 FITC 20 μL，加入100 μL血液，混匀后室温避光温育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解红细胞，避光温育10 min后，用鞘液洗涤1次，加0.5 mL鞘液上流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件，GraphPad Prism 5 Demo软件。符合正态分布计量资料以（）表示，非正态分布计量资料用M（Q1，Q3）表示。手术前后的对比采用配对t检验或配对秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料 肝癌患者在化疗后WBC、N%、M%等各项指标比化疗前均有不同程度的上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 化疗前和化疗后患者的血细胞及肝功能比较

2.2 外 周 血 中Treg和CD45modCD11b+CD14-CD15-细胞的变化情况患者化疗前和化疗后的CD45modCD11b+CD14-CD15-差异有统计学意义（Z=-3.131，P=0.002），见图1。而化疗前后Treg比较差异无统计学意义（Z=-0.017，P=0.987），见图2。

图1 患者化疗前后外周血Treg细胞占比

图2 患者化疗前后外周血CD45modCD11+CD14-CD15-细胞占比

2.3 外周血中T淋巴细胞亚群的变化情况 CD4（Z=-1.523，P=0.128）、CD8（Z=-1.235，P=0.217）和CD4/CD8（Z=-0.163，P=0.871）手术前后差异无统计学意义。见图3、4、5。

图3 患者化疗前后外周血CD4+T细胞绝对计数

图4 患者化疗前后外周血CD8+T细胞绝对计数

图5 患者化疗前后外周血CD4+/CD8+比值

3 讨论

机体抗肿瘤免疫反应以细胞免疫为主，T淋巴细胞起主要调控作用，CD3阳性细胞代表总T淋巴细胞，CD4+和CD8+分别代表T淋巴细胞的两个亚群，其中CD4+细胞为辅助T细胞，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，还可以分泌大量细胞因子以提高CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，CD8+T细胞包括细胞毒性T细胞和抑制性T细胞，分别具有杀伤肿瘤细胞和抑制机体免疫应答的功能，正常情况下两者处于动态平衡，共同参与机体的免疫应答。但大多数肿瘤存在肿瘤免疫逃避机制，这也是肿瘤细胞在机体中难以被彻底清除的原因所在。髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg）在感染产生的免疫抑制环境和肿瘤诱发的免疫抑制过程中发挥重要作用［5-6］。MDSC主要由处于早期分化阶段的髓系细胞组成，是一群具有异源性、可塑性的未成熟髓系细胞［7］，由于其表型在不同的疾病或研究报道中各不相同，目前只能通过其免疫抑制功能确认。Treg在人的外周血及淋巴组织中约占CD4+T细胞的5%～10%，其中天然Treg（nTreg）大部分为CD4+CD25+Treg，以其表面高表达CD25，同时表达CD4，低表达CD127为特征［8］。

在本实验中，对HCC患者行TACE术前后的T淋巴细胞亚群检测发现化疗后CD4T细胞、CD8T细胞和CD4/CD8比值均低于化疗前的检测值，差异无统计学意义，可能原因是标本量较少。免疫表型进一步的检测发现Treg的表达在化疗后比化疗前有所增加，但差异无统计学意义。本次实验根据MDSC为早期分化阶段的髓系细胞的定义，检测免疫表型为CD45modCD11b+CD14-CD15-的细胞在化疗栓塞术后3天的变化，发现虽然化疗后早期HCC患者外周血白细胞总数及中性粒细胞和单核细胞比例均有不同程度的上升，但本实验中代表MDSC的CD45modCD11b+CD14-CD15-细胞在化疗后的表达与化疗前相比下降，差异有统计学意义（P=0.002）。作者认为，在化疗后早期，由于化疗造成的组织细胞破坏必然引起机体的快速防御反应，因此髓系系统的中性粒细胞和单核细胞增多，然而反应需更多时间的特异性免疫系统则未见明显变化。本实验中处于早期分化阶段的髓系细胞CD45modCD11b+CD14-CD15-细胞的明显变化或许可提示MDSC能够反映肝癌患者在接受化疗栓塞术后早期的细胞免疫状况的变化，进而为患者的长期预后提供预判。为证明这一点，需长期随访患者，并纳入更多的研究对象。基于MDSC在肿瘤免疫调节中的重要作用，以及本实验中CD45modCD11b+CD14-CD15-细胞在肝癌患者化疗后早期有明显的变化，提示MDSC可能成为肝癌患者疗效检测和预后判断的指标寻找的切入点，值得进一步探寻。