曾阳 陆锋艺 庄汝杰

膝关节骨性关节炎（KOA）是临床中常见的关节退行性疾病，以慢性关节疼痛及活动受限为主要临床特点，好发于中老年人群，是中老年人致残的主要因素之一［1］。现阶段国内外对KOA的研究主要集中在炎症反应方面，各种炎性因子的释放导致膝关节中积液增多，刺激滑膜组织增生，软骨破坏［2-3］，其中MMP-13等一系列基质金属蛋白酶被认为在软骨破坏中起主要作用［4］，且膝骨关节炎患者中IL-6水平显著增高［5］。有研究表明［6］，氯膦酸二钠脂质体对巨噬细胞具有耗竭作用，而巨噬细胞能释放包括IL-6在内的多种炎症介质。本文探讨氯膦酸二钠脂质体对小鼠膝骨关节炎（KOA）的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 8周龄健康雄性C57BL/6小鼠（购自浙江中医药大学动物实验中心），氯膦酸二钠脂质体（LIPOSOMA），RNA 纯化试剂盒（Invitrogen），RNase-Free DNA 清除试剂盒（Qiagen）、SuperScript® III逆转录酶预混液（Invitrogen）、SYBR®Green PCR预混液、高速冷冻离心机（Sigma），紫外分光光度计（Beckman）、CFX384多重实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）等。

1.2 动物实验方法 将30只SPF级8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，以随机数字表法分为对照组、空白组、治疗组，每组各10只，对照组、治疗组小鼠均进行DMM造模法建立小鼠KOA模型，空白组不造模。造模步骤参考WELCH等［7］方法，手术后第4周关节炎造模成功。治疗组小鼠在造模成功前1周注射氯膦酸二钠脂质体（1 mg/mL）1次，进行巨噬细胞耗竭，第4周后继续注射氯膦酸二钠脂质体，1次/周；对照组小鼠及空白组小鼠同步注射0.9%氯化钠溶液20 μL，1次/周。

1.3 检测方法 （1）总RNA提取：取样品，关节处碾磨碎，根据说明书使用TRIzol® Reagent提取RNA。紫外分光光度计和电泳测定其含量、纯度及质量，然后贮存在-80℃备用。（2）逆转录实验：加入RNase-Free Water补充至 20 μL，反应条件：25℃，10 min；50 ℃，30 min；85℃，5 min，贮存在 -20℃备用（见表 1）。（3）Real-Time PCR检测：采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件进行定量PCR引物设计，然后由生工生物工程（上海）股份有限公司负责合成，引物序列见表2。反应条件为95℃，1 min；40个循环（95℃，15 s，63℃，25 s，收集荧光），绘制熔点曲线。进行Real-Time PCR基因表达差异分析，每个样品重复3次，各个基因的相对表达水平以2-ΔΔCt进行统计分析。

表1 1st-Strand cDNA Synthesis反应体系及条件

表2 Real-Time PCR 引物和条件

1.4 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计软件。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

在4周和8周时，空白组和治疗组中IL-6、MMP-13表达水平均低于对照组（P＜0.05）；治疗组与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），治疗组4周与8周IL-6、MMP-13表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。

表3 各组不同时点IL-6、MMP-13表达水平比较［pg/mL，（）］

表3 各组不同时点IL-6、MMP-13表达水平比较［pg/mL，（）］

注：与4周对照组比较，*P＜0.05；与8周对照组比较，△P＜0.05

组别 IL-6 MMP-13对照组 4周 211.63±79.33 94.33±6.07 8 周 233.77±44.89 102.54±29.06空白组 4周 39.05±6.23* 20.71±2.81*8周 56.25±13.63△ 12.55±1.07△治疗组 4周 53.44±15.09* 32.03±4.95*8周 26.92±2.97△ 17.24±1.83△

3 讨论

早期KOA的主要病理表现为软骨破坏分解与自发的软骨修复，在这个过程中，由软骨细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等分泌的一些细胞因子被释放进入血液和关节液中，其中IL-6是参与KOA发病过程中重要的细胞因子，与滑膜炎性病变、关节软骨基质降解及干扰软骨细胞功能密切相关［8］。IL-6由软骨细胞和滑膜成纤维细胞分泌并交叉调节介导，可诱导IL-1增加MMP的合成，抑制蛋白多糖产生［9］，而MMP-13由于其对切割II型胶原的特异性而在软骨重塑和降解中具有关键的限速功能，可通过多种方式和多条通路调节骨骼发育和骨重建［4］。在实验性OA早期，培养的不同类型的关节炎滑膜细胞均可见IL-6 mRNA表达，关节液中亦可检测出IL-6活性物质，KOA患者关节液和血清中IL-6含量均高于正常人［10-11］。

氯膦酸二钠脂质体是一种人工合成的双膦酸脂，在临床中多用于骨质疏松的治疗［12］。当氯膦酸二钠脂质体在膝关节腔内被巨噬细胞吞噬，被释放出的氯膦酸二钠在巨噬细胞内聚集，当积累到一定程度后，巨噬细胞逐渐失去活性［13］。

本试验结果显示，造模组在4周和8周的IL-6、MMP-13表达水平均高于空白组，这进一步验证IL-6、MMP-13参与膝骨关节炎的发展过程；治疗组4周与8周组内比较，两组IL-6、MMP-13表达水平差异无统计学意义，这表明氯磷酸二钠脂质体能有效降低膝骨关节炎模型中IL-6、MMP-13表达水平，并表现出持久的作用。MMP-13在空白组中表达较低，在造模组中随造模时间延长，其表达水平升高，这可能与本模型中滑膜炎表现随造模时间延长持续加重有关，这与YOSHIHARA［9］等研究结果相一致。本课题前期实验表明，氯膦酸二钠脂质体对关节软骨具有保护作用，能有效降低关节表面破坏，保留较多的健康完整的软骨细胞；且在细胞模型验证其对巨噬细胞的耗竭作用。本实验进一步验证氯膦酸二钠脂质体能有效降低膝骨关节炎模型中IL-6、MMP-13表达水平，并将其维持在较低水平。