黄小松，章荣军，崔明娟，郑俊杰

(华中科技大学 岩土与地下工程研究所，武汉 430074)

近年来，MICP技术在重金属污染土体/水体修复领域的应用潜力被广泛探究。MICP技术利用微生物固定重金属离子，可降低重金属的可迁移性、活性和生物毒性[8]。大量研究从污染环境中分离出重金属耐受性强的土著微生物，如黄色考克氏菌(KocuriaflavaCR1)[9]、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)[10]、微杆菌(Exiguobacteiumundae)[11]、蜡状芽孢杆菌(BacilluscereusYR5)[12]和肿大地杆菌(Terrabactertumescens)[13]等，并探究其固定/去除重金属的潜力。但研究发现，相较于巴氏芽孢杆菌(Sporosarcinapasteurii)，其他土著微生物的脲酶表达量较低。

巴氏芽孢杆菌适应性强、脲酶活性高、环境友好[14]，此前主要应用于砂土固化等领域[15-16]。近年来，部分学者开创性地将巴氏芽孢杆菌应用于重金属污染水体的修复，并证明其具有去除重金属的潜力[13,17-18]。但研究显示，超过一定浓度后重金属会抑制微生物活性，影响生物修复效果，如Cu2+易被微生物吸收，致使其蛋白质变性并丧失功能；同时，生物矿化形成的碳酸铜沉淀会附着在碳酸钙表面，从而阻止MICP反应进一步进行[17-18]，因此，有必要在高浓度范围内探究巴氏芽孢杆菌固定/去除重金属的能力。此外，常用的生物修复工艺效率较低[17-18]。目前大部分研究仅根据MICP理论分析巴氏芽孢杆菌固定/去除重金属的机理，较难解释生物修复这一复杂的生物化学过程。

为避免腐殖土体颗粒和渗滤液物化特性的影响，笔者以Zn、Cu、Ni、Cd和Cr(Ⅲ)等重金属污染溶液为研究对象，采用简单拌和法开展生物修复重金属污染溶液试验，确定巴氏芽孢杆菌对不同重金属的去除能力，并分析修复时间、重金属种类和浓度等因素对生物修复效果的影响；基于MICP和化学平衡理论，利用Visual MINTEQ软件对微生物修复重金属污染溶液的过程进行简化模拟，对比试验和模拟结果，并结合XRD表征结果，分析微生物固定/去除重金属的机理。

1 试验内容

1.1 试验用菌种

试验使用从中国普通微生物菌种保藏管理中心购入的巴氏芽孢杆菌(Sporosarcinapasteurii)，菌种编号为CGMCC 1.3687。菌种的活化和扩大培养均使用相同的培养液，其成分包括：20 g/L酵母提取物、10 g/L NH4Cl、10 mg/L MnSO4·H2O和24 mg/L NiCl2·6H2O。将各成分按比例混合均匀后，用1 mol/L NaOH调节培养液pH值至8.5。接种微生物前，培养液需经121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。菌种活化时，取适量购入的细菌冻干粉加入100 mL无菌培养液中，在30 ℃、170 r/min摇床中培养48 h。基于活化后的菌液进行扩大培养得到试验用菌液，使用分光光度计测得菌液光密度(OD600)为2.0左右，脲酶活性为10 U/mL。培养完成的菌液需放置在4 ℃恒温环境中保存。

1.2 微生物修复重金属污染溶液

1.2.1 试验工况 试验主要探究重金属种类、浓度和修复时间对生物修复效果的影响。设置Zn、Cu、Ni、Cd和Cr(Ⅲ)5个试验组。各试验组根据重金属初始浓度分为6个工况，工况0不添加重金属，为对照组；工况1中重金属浓度根据《绿化种植土壤》[19]重金属含量技术要求值(Ⅲ级)换算得到，工况2～5中重金属浓度在工况1的基础上依次递增。此外，分别在1、2、4、8、12、24、48 h检测各试验参数。具体试验方案见表1。

表1 微生物修复重金属污染溶液试验方案

1.2.2 试验步骤 微生物修复重金属污染溶液试验包括制备重金属污染溶液和生物修复重金属污染溶液两大步骤：

2)制备生物修复重金属污染溶液：生物修复试验在250 mL烧杯中进行，将50 mL菌液与同体积的重金属污染溶液混合均匀。混合完成时尿素和CaCl2的浓度为0.5 mol/L，各重金属离子浓度见表1。分别在不同时间测定pH值、重金属离子浓度和Ca2+浓度等试验参数。其中，pH值使用pH计(pH-100A)测定；重金属离子浓度和Ca2+浓度使用原子吸收分光光度计(AA-6880)测定。试验中同种工况设置3个平行试样，测试值平均后得到最终的结果。

1.2.3 试验指标 采用生物修复完成率(γi)、重金属残余率(δ)和Ca2+残余率(ε)等试验指标表示生物修复的进行程度和效果，计算过程见式(1)～式(3)。其中，αi和βi分别为ih的重金属离子浓度和Ca2+浓度。由于48 h时生物修复反应基本完成，因此，将ih已去除重金属浓度(α0-αi)与48 h已去除重金属浓度(α0-α48)相比得到生物修复完成率，以表示生物修复进行程度，1～48 h时生物修复完成率小于等于100%。重金属残余率(δ)和Ca2+残余率(ε)则是48 h时溶液中残余离子浓度(α48或β48)占初始离子浓度(α0或β0)的百分比，以此表征生物修复效果。残余率(δ或ε)越高，生物修复效果越差。

(1)

(2)

(3)

1.3 Visual MINTEQ软件模拟

1.4 XRD分析

使用X射线衍射仪分析试验生成固相沉淀的成分。在进行X射线衍射分析前，将收集的沉淀烘干并研磨，并用0.1 mm细筛筛分。检测的结果使用软件MDI Jade 6鉴定。

2 结果与讨论

2.1 生物修复完成率与修复时间的关系

相同试验组(重金属种类相同)不同工况(重金属浓度不同)下的生物修复完成率随时间的变化差异不大，因此，图1仅展示各试验组工况1的生物修复完成率与时间的关系。如图1所示，Cr(Ⅲ)试验组的生物修复完成率几乎不随修复时间变化，始终接近100%，表明溶液中游离态的Cr(Ⅲ)在微生物诱导下迅速沉淀。随着反应进行，Ni、Zn、Cd试验组的生物修复逐渐完成，并分别在24、24、2 h时趋于稳定。由于Cu2+未被去除，因此图中显示Cu试验组生物修复完成率为0。

图1 生物修复完成率与时间的关系

其他学者在开展生物修复重金属污染溶液试验时菌液与污染溶液体积比较小，并在微生物生长过程中修复重金属，通常需要72 h才能完成修复处理，如表2所示。试验采用简单拌和法，将菌液和污染溶液按照体积比1∶1进行混合，提高溶液体系菌液初始浓度，早期脲酶浓度增多，尿素快速水解，因此，生物修复速率显著提高。

表2 生物修复时间统计

2.2 重金属生物修复效果

图2～图4分别展示了48 h时重金属残余率、Ca2+残余率、pH值与重金属种类和浓度的关系。在本研究的重金属浓度范围内，以重金属残余率为主要评价指标，将巴氏芽孢杆菌对不同重金属的生物修复效果分为：

1)良好且稳定，如对重金属Cd和Cr(Ⅲ)。Cd和Cr(Ⅲ)试验组的重金属残余率均接近0%(如图2所示)，Ca2+残余率低于10%(如图3所示)。此外，试验过程中发现，经修复处理后溶液体系的pH值呈现不同程度的增长，最终达7.4左右(如图4所示)。Li等[13]和Jalilvand等[17]同样发现，巴氏芽孢杆菌对Cd2+耐受性强，生物修复效果好。此外，此前研究表明微生物可通过诱导Cr(Ⅵ)生成CaCrO4或将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)以完成去除[21-22]，但几乎没有研究探究微生物对Cr(Ⅲ)的去除。研究结果显示，巴氏芽孢杆菌同样可有效去除Cr(Ⅲ)，具体机理将结合Visual MINTEQ软件模拟结果和XRD结果进行分析。

图2 重金属残余率与重金属种类和浓度的关系

图3 Ca2+残余率与重金属种类和浓度的关系

图4 pH值与重金属种类和浓度的关系

2)非稳定，如对重金属Zn。图2显示，当Zn2+浓度在500～1 000 mg/L范围时，重金属残余率低于10%。但当离子浓度高于1 000 mg/L时，重金属残余率迅速增加，最终达到47.5%。同时，Ca2+残余率明显增加(如图3所示)。因此，在研究浓度范围内，随着Zn2+初始浓度增加，生物修复效果明显降低。Jalilvand等[17]研究表明，Zn2+最低抑制浓度为195 mg/L；Mugwar等[18]同样发现，当Zn2+初始浓度高于130 mg/L时，巴氏芽孢杆菌活性开始受到抑制。综上所述，巴氏芽孢杆菌仅可在一定浓度范围内高效去除Zn2+。

3)欠佳，如对重金属Ni和Cu。Ni试验组结果显示，Ca2+残余率稳定在20%～30%(如图3所示)，表明Ni2+不会显著抑制微生物活性，但Ni2+残余率始终保持在80%～92%(如图2所示)，生物修复效果不佳。Gheethi等[23]研究表明，当Ni2+浓度在0.1～0.8 mg/L范围内时，巴氏芽孢杆菌可通过生物富集作用去除50%～80%的重金属离子，且随着Ni2+初始浓度增加，生物去除率降低。因此，研究中巴氏芽孢杆菌可能同样通过生物富集作用去除Ni2+，但由于Ni2+浓度较高，导致生物修复率始终较低。

Cu试验组结果显示，在本研究浓度范围内(Cu2+初始浓度为400～2 000 mg/L)，重金属残余率和Ca2+残余率均接近100%(如图2和图3所示)，且与其他试验组不同的是，经生物修复后Cu试验组pH值略微降低(如图4所示)。试验的上述现象(如图2和图3所示)表明，溶液中的尿素或并没有被微生物水解，巴氏芽孢杆菌的活性可能完全丧失。其他研究表明，即使当Cu2+浓度较低(32～320 mg/L)时，巴氏芽孢杆菌对Cu2+去除效果仍不佳[18,24-25]。因此， Cu2+浓度相对较高，微生物活性被显著抑制。

2.3 试验值和模拟值的比较

图5和图6分别为不同试验组重金属残余率和Ca2+残余率试验值和模拟值的比较。由于通过纯化学平衡不能生成Cd相关的沉淀，因此，Cd试验组重金属残余率模拟值为100%(图5(a))。图5(b)～(e)显示，Cr(Ⅲ)、Zn、Cu和Ni试验组的重金属残余率模拟值基本稳定在10%以下，其中，模拟结果显示游离态Cu2+、Ni2+、Zn2+可分别转化为CuCO3、NiCO3、ZnCO3，Cr3+则以Cr2O3形式沉淀。图6(a)～(e)表明，溶液体系中的Ca2+几乎可完全被诱导生成CaCO3沉淀。综上，基于MICP和化学平衡理论，在尿素完全水解时，大部分金属离子将以碳酸盐或氧化物的形式沉淀。

图5(b)和图6(b)显示，Cr(Ⅲ)试验组的试验值和模拟值基本一致。但其他试验组的试验值和模拟值存在差异：1)图5(a)显示Cd试验组重金属残余率试验值几乎为0%，但模拟结果显示无Cd相关沉淀生成。由于纯化学平衡不能生成Cd相关沉淀，但有研究表明Cd2+可能通过CaCO3的吸附作用被去除[26]，因此，试验值和模拟值差异较大；2)图5(c)、(d)和图6(c)、(d)显示，Zn和Cu试验组的重金属残余率和Ca2+残余率试验值不同程度地高于模拟值。已有研究表明，超过重金属最低抑制浓度后，重金属会抑制微生物活性，尿素水解不充分或几乎未被水解，生物修复反应被抑制或终止[17-18,24-25]。因此，试验中Cu2+和Zn2+浓度较高，巴氏芽孢杆菌活性受到抑制；3)试验表明，巴氏芽孢杆菌可能通过生物富集作用去除Ni2+,但去除效果有限，因此，试验值和模拟值存在较大差异(图5(e)和图6(e))。

图5 重金属残余率试验值和模拟值

图6 Ca2+残余率试验值及模拟值

2.4 XRD分析

图7 XRD分析结果

3 结论

通过巴氏芽孢杆菌生物修复重金属污染溶液试验，对比试验值和Visual MINTEQ软件模拟值，并结合XRD对固相沉淀成分的分析结果，得到如下结论：

1)巴氏芽孢杆菌具有高效修复高浓度重金属污染溶液的潜力。在本研究重金属浓度范围内，巴氏芽孢杆菌几乎可完全去除Cr(Ⅲ)、Cd2+；随着Zn2+初始浓度增加，其修复效果降低，具体表现为重金属残余率从3.7%增至47.5%；但巴氏芽孢杆菌对Ni2+和Cu2+去除效果不佳。

2)巴氏芽孢杆菌可能通过生物矿化和生物富集作用去除重金属离子，如巴氏芽孢杆菌可诱导Cr(Ⅲ)和Zn2+生成氧化物和碳酸盐沉淀，并可能通过生物富集作用去除Ni2+。

3)研究采用的简单拌和法操作简便，生物修复效率更高，具有生物修复重金属污染溶液和沉积物工程应用的潜力。