巫裕花，徐彩玲，傅嘉慧，熊 符，杨 芳

0 引 言

宫内生长受限(intrauterine growth restriction, IUGR)/胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)不仅是围产儿患病和死亡的重要原因，而且还与儿童期的认知障碍和成人期疾病(肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、卒中等)的发生风险的增加相关[1]。IUGR发病原因复杂，其发生机制也受多因素影响，包括胎儿、母体以及胎盘等。其中胎盘异常导致胎盘功能不全是IUGR常见的病理原因[2-3]。胎盘是母胎进行营养物质交换的枢纽，为胎儿在宫内发育提供营养[4]。因此，胎盘自身的营养障碍会导致胎儿生长受限。为进一步研究IUGR的分子发病机制，寻找IUGR相关的生物标记物，更好地为IUGR的诊断、治疗和预防提供科学依据，本研究基于生物信息学方法对IUGR患者的转录组学数据进行分析，发掘出IUGR发病过程中可能发挥作用的基因并进行验证，为临床上进一步研究IUGR不同治疗方案的疗效，以指导临床诊断及治疗提供方向。

近年来，导致IUGR发生的机制研究已取得一些成果。有研究表明，胎盘乳源被认为对胎儿发育的调节具有重要意义，并且是母体和胎儿代谢状态的临床生物标志物，妊娠期间PL的降低与IUGR的发生率升高有关[5]。相关研究表明，孕妇循环血管中的胎盘生长因子和可溶性FMS样络氨酸激酶-1已成为IUGR的诊断标记物[6]。Zhang等[7]研究发现，血管生成素样4异常羟甲基化可能通过选择性宫内胎儿生长受限(sIUGR)较小胎盘份额中的HIF-1信号传导途径导致胎盘损伤。运用生物信息学分析基因芯片可以筛选出致病的枢纽基因，从而发现该病的诊断标志物。目前，GEO平台已公开发表了多个IUGR胎盘基因芯片数据。本研究通过挖掘公共数据库中的数据集，结合加权基因共表达网络分析分析参与IUGR发病的关键基因，从而为找出IUGR的诊断标记物提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据收集与数据预处理在NCBI的GEO数据库(https://www.ncbinlm.nih.gov/geo/)上以“IUGR(intrauterine growth restriction,宫内生长受限)”、“人胎盘组织样本”为搜索条件，根据样本量的大小，挑选了GSE100415和GSE12216数据集。基于研究目的，我们选取了GSE100415数据集的86个样本，其中59例为IUGR，27例为正常样本。利用GEO2R在线工具将59例IUGR和27例正常的胎盘组织的基因进行比较，得到14 037个基因的表达矩阵。

1.2基因共表达网络构建挑选变异系数最高的7000个基因进行后续分析。剔除离群值样本使构建的网络更稳定，再使用R软件的WGCNA包，选择适当的软阈值β，进一步构建拓扑重叠矩阵TOM，利用层次聚类产生一个基因的层次聚类树。通过计算基因显著水平(gene significance, GS)以及模块成员度(module membership，MM)，用以衡量基因与临床信息的显著性，并分析模块及模型的显著关联。

1.3基因功能富集分析为识别出所选出模块内基因所具有的生物学功能，将模块内的基因上传至DAVID数据库进行基因本体论(gene ontology，GO)分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，并使用R语言中的DOSE包，对模块基因进行疾病本体论(disease ontology, DO)富集分析。以上定义P<0.05为显著富集。

1.4枢纽基因的筛选与验证设置参数MM和GS筛选枢纽基因；另外将枢纽模块中的基因上传至STRING数据库(https://string-db.org/)构建靶基因蛋白相互作用(PPI)分析，并将蛋白互作关系网络数据上传至cytoscape，进一步筛选出关键基因。取上述两者之间的交集得出候选基因。在GSE100415数据集中，通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线去预测诊断标志物对IUGR的预测能力，计算曲线下面积(AUC)，同时基于独立的GSE12216数据集验证所获得的枢纽基因的诊断效率。

1.5实验验证

1.5.1 一般资料为验证上述的生物信息学分析的结果，收集2020年10月-2021年4月在南方医科大学附属南方医院和珠江医院的住院分娩17例胎儿生长受限的患儿，诊断标准参照文献[1]，并选择同期本院住院分娩的16例正常胎儿作为对照组。对照组纳入标准：①孕周37～41周；②出生体重、出生头围和出生身长均正常。排除标准：①胎儿畸形和双胎；②胎儿染色体异常；③孕妇凝血功能障碍；④孕妇患有糖尿病，子痫等妊娠并发症。

1.5.2引物设计和合成根据Gen Bank中人GAPDH mRNA，LDHA mRNA和HK2 mRNA序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成，设计的引物序列见表1。

表1 RT-qPCR使用的特异性引物序列

1.5.3RT-qPCR检测实验方法按照商品使用说明书，Trizol试剂从胎儿生长受限胎盘组织和正常胎儿的胎盘组织中分别提取总RNA，ND-1200核酸定量检测仪(Thermo)测定总RNA浓度和吸光度，以1.8≤吸光度值≤2.2为合格。根据Evo M-MLV RT Premix for qPCR说明书合成cDNA，使用Evo-M MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR 10 μL进行PT- qPCR，反应在7500实时定量PCR仪中进行，以GAPDH为内参，上游引物(10 μmol/L)0.2 μL，下游引物(1 μmol/L)0.2 μLcDAN 1 μL，ROX 0.2 μL;RNase Free Water3.4 μL；SYBR 5 μL。 反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；共40个循环，采用2-△△CT值方法进行表达量相对定量分析。

1.6统计学分析采用SPSS 20.0软件统计学分析。HK2、PIK3CB和OCRL在胎儿生长受限胎盘组织中和正常胎盘组织中表达差异的分析采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 芯片数据预处理及加权基因共表达模块的构建GSE100415芯片数据及临床信息的下载与预处理，最终获得86个样本对应14 037个基因的表达矩阵，选取变异系数最大的前7000个基因进行下一步分析。绘制样本聚类图，剔除3个离群值样本后，得到IUGR 57例和正常对照组26例,见图1a。通过WGCNA包的算法，根据无尺度网络分布拟合，选取β=5作为软阈值，见图1b，并计算基因间的相关性矩阵和TOM，使用TOM构建基因间分层聚类树，合并相似模块后得到15个模块,见图1c。其中blue模块与IUGR的相关性最高(r=0.73，P<0.01)，见图1d。同时，将MM相对于GS做散点图，可见blue模块内GS与MM存在较好的相关性(cor=0.86,P<0.01)，见图1e。因此，blue模块可以作为与IUGR密切相关的枢纽模块。

a:样本聚类图；b:不同软阈值功率；c:基因共表达网络分层聚类树与共表达模块；d:基因模块与IUGR之间的相关性热图；e:blue模块基因的GS与MM的散点图

2.2模块内基因功能富集分析在“blue”模块中，选取|GS|>0.4且|MM|>0.6共336个基因进行GO，KEGG以及PPI分析。 “blue”模块1005个基因的疾病本体论(disease ontology，DO)分析结果如图2a所示，富含blue模块基因的疾病主要包括营养代谢性疾病、癌症和溶酶体储存疾病。KEGG结果表明，富集的途径主要涉及葡萄糖、氨基酸等代谢相关通路，HIF-1信号通路和癌症相关通路以及胰岛素信号通路以及免疫相关的信号通路，见图2b。GO富集结果表明，blue模块内的基因主要富集在葡萄糖、蛋白质代谢反应、低氧反应、信号转导、典型糖酵解等过程。以上3种生物信息学分析方法均表明“blue”模块内的基因与胎盘的营养代谢障碍有关。因此，胎盘的营养代谢障碍可能是导致IUGR发生的重要原因。

a： DO富集分析结果泡泡图； b: KEGG富集结果泡泡图；c: GO富集分析的结果泡泡图

2.3诊断标志物的筛选和验证对blue模块基因以MM>0.8且GS>0.6为参数筛选出39个枢纽基因。同时将blue模块基因中1005个基因上传至STRING数据库，并将得到的蛋白-蛋白相互作用网络通过使用cytoscape的“MCC”算法，选出评分最高的30个关键基因。两者取交集得到HK2、LDHA、OCRL、PIK3CB、PKM共5个诊断标志物的候选基因。在GSE100415数据集中，通过对5个候选基因进行ROC分析，结果表明曲线下面积(area under curve，AUC)值均在0.9以上,见图3。为进一步验证这5个候选基因的诊断功效，以GSE12216数据集作为验证集，对5个候选基因进行了验证，除了PKM和PIK3CB外的3个候选基因均在验证集中达到了较高的水平(AUC>0.7)，提示该方法的可靠性,见图4。

图3 GSE100415数据集中5个诊断标志物的ROC曲线

图4 GSE12216验证集中5个诊断标志物的ROC曲线

2.4RT-qPCR实验分析胎儿生长受限胎盘组织和正常胎盘中候选基因表达含量RT-qPCR实验表明，胎儿生长受限胎盘组织中HK2，PIK3CB和OCRL的表达水平均显著低于正常胎盘组织(P<0.05)。LDHA和PKM等候选基因差异均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

与IUGR组比较，*P<0.05、**P<0.01

3 讨 论

IUGR是产科常见且复杂的妊娠并发症，不仅表现为围产期死亡率高，而且显著影响后代个体存活率和健康状态[8]。本研究利用IUGR和正常人的胎盘组织芯片数据集GSE100415进行生物信息学分析。通过WGCNA方法，发现blue模块与IUGR相关性最高，同时对blue模块内的基因进行了富集分析，GO富集分析表明blue模块基因主要与应对缺氧、蛋白质代谢、厌氧糖酵解有关；DO富集的疾病主要与代谢性疾病有关。以上结果表明营养物质代谢在IUGR中起重要作用。此外，KEGG富集的途径主要涉及葡萄糖、氨基酸等代谢相关通路，与疾病相关的信号通路如HIF-1信号、胰岛素信号通路、癌症相关通路以及免疫相关的信号通路。同时，有相关的研究表明，胎盘糖代谢异常可对胎儿宫内发育迟缓有重要的调控作用[9]。以上研究结果与我们的分析数据相符，表明本研究的分析结果有可信度。

通过WGCNA中的blue模块进行筛选，得出PKM、LDHA、HK2、PIK3CB、OCRL共5个诊断标志物的候选基因。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，来探究5个候选基因的预测能力，发现在数据集GSE100415中,5个候选基因AUC值均在0.8以上。为了进一步验证这5个候选基因的诊断意义，以GSE12216数据集作为验证集，对5个候选基因进行了验证，除了PKM和PIK3CB。其余诊断标志物均在验证集中达到了较高的水平(AUC>0.7)，提示该方法的可靠性。

胎盘是母体和胎儿之间的营养物质和氧气交换的场所，胎儿生长状况在很大程度上取决于胎盘将母体营养物质转运到胎儿循环中的能力，胎盘功能不足将导致胎儿生长受限发生率的增加。而葡萄糖、氨基酸和游离脂肪酸是胎儿正常生长所必需的营养物质，通过主动运输从胎盘的滋养层向胎儿输送营养物质[10]。

通过RT-q PCR检测宫内生长受限胎儿的胎盘组织和正常胎盘组织中的HK2、LDHA、OCRL、PIK3CB、PKM的表达水平，发现在IUGR胎盘组织中的HK2，PIK3CB和OCRL的表达水平均低于正常胎盘组织，差异具有统计学意义。结合上述的实验结果，我们推测HK2，PIK3CB和OCRL可能为IUGR的重要诊断标志物。

己糖激酶2(Hexokinase-2, HK2)是一种糖酵解关键酶，负责启动无氧葡萄糖代谢，同时也是一种催化瓦式效应的关键酶[11]。有文献报道，癌细胞即使在氧气充足的条件下，葡萄糖仍然大量通过糖酵解过程进行代谢，上述现象为瓦氏效应[12]。瓦式效应能够帮助胚胎在母体子宫中着床，同时为胎儿的生长发育提供更多的能量[12]。也有相关的文献报道，HK2的下调可能通过抑制胎盘内的糖酵解和损害子宫蜕膜的作用，导致了胎盘的功能不全，诱导了子痫(preeclampsia, PE)的发生[13]。PIK3CB(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit beta，PIK3CB),又被称为磷酸三激酶(PI3K)，是信号通路PI3K/AKT中的关键分子。过去几十年的胎盘滋养层的研究中，发现了滋养层细胞具有与癌细胞在增殖、迁移和侵袭特性等方面具有惊人相似之处，其中PI3K/AKT通路是实现胎盘滋养层细胞增殖、迁移和侵袭过程中的关键信号通路[14-15]。而PIK的下调，将导致胎盘功能不足，未能获得足够的母体血供，影响胎儿与母体之间的营养物质交换，导致PE或者IUGR的发生[16]。肌醇多磷酸盐-5-磷酸盐(inositol polyphosphate-5-phosphatase,OCRL)是细胞运输的关键调节器。它通过调节细胞作用因子动力学，不仅影响了细胞的迁移和侵袭，而且调节了细胞膜的运输作用，如囊泡运输和內吞等[17-18]。同时OCRL在胎盘组织中显著表达[19]。因此，推测OCRL的下调，导致胎盘的侵袭和摄取营养物质等功能受到损害。

综上所述，本研究通过WGCNA生物信息分析方法，筛选出1个枢纽模块，通过GO，KEGG和DO分析表明，胎盘的营养障碍可能是IUGR发生的重要机制，而HK2，PIK3CB和OCRL作为枢纽基因，也可能是IUGR的诊断标记物，其诊断作用仍然需要后续的大样本临床实验中得到进一步验证。