何 颖，雷 梓，李 庚，喻 意，杨 园，刘 慧，潘国庆

0 引 言

研究表明胃癌发生与幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)感染密切相关[1]。流调资料显示在不同的地域,胃癌发生率差异显著,东亚地区人群胃癌发生率较高,而在非洲和南亚地区,虽然Hp感染率很高,但胃癌发生率却较低，西方人群Hp感染率为30%，Hp相关性胃炎患者中最终发生胃癌者仅占0.1%～1%[2-3]，提示不同遗传背景的个体在相同的环境暴露下其胃癌的易感性不同。这种易感性目前被认为是由个体的遗传因素所决定，其中最常见莫过于单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)，SNP是个体间遗传差异的主要形式。神经轴突导向分子5A(Semaphorin 5A，SEMA5A)在多种病理生理过程中发挥重要作用[4]，我组前期研究已发现SEMA5A与Hp感染及胃癌发生发展相关[5-8]。既往研究发现SEMA5A基因rs7702187位点的多态性是中国西部人群帕金森病的高风险因素(P=0.20，OR=0.87，95%CI=0.79～0.96)[9]。但目前SEMA5A基因SNPs与肿瘤发生发展关系的研究较为有限，未有SEMA5ASNPs与胃癌易感性关系的报道。故本研究基于临床病例对照研究方法，探讨SEMA5A基因SNP位点在胃癌患者和健康者的分布特点，同时研究SEMA5A基因多态性和Hp感染在胃癌发生中的交互作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2018年10月至2020年10月在昆明医科大学第一附属医院确诊为胃癌的230例患者病历资料和血液，对照组为同期在我院体检的健康体检者250例。所有研究对象来自云南地区汉族人群，年龄 37～89岁，胃癌组平均年龄(60.03±1.52)岁，对照组平均年龄(61.43±0.79)岁，胃癌组Hp阳性134例(58.3%)，Hp阴性96例(41.7%)；对照组Hp阳性97例(38.8%)，Hp阴性153例(61.2%)。所有患者均经胃镜和病理诊断确诊为胃癌，病例收集标准：为原发性胃癌，且既往均无肿瘤遗传病史，均未进行过放疗和化疗，排除继发性或复发性肿瘤及其他恶性肿瘤；对照组与胃癌组患者的年龄、性别情况相匹配，2组对象无血缘关系。所有研究对象均了解所有研究内容并签订知情同意书，并经过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准[批准号(201809-25)]。

1.2 试剂和仪器ELISA试剂盒(福建三强公司试剂盒)；DNA 提取试剂盒(南京诺唯赞生物)；9700 型PCR 扩增仪(美国ABI公司)；3730XL基因测序仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.3 采集和保存每位研究对象抽取约4 mL空腹外周静脉血于EDTA-K2抗凝管中，室温静置20 min，400 × g离心5 min分离血清血浆，分装后置-20 ℃冰箱保存。

1.4 Hp感染检测应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中Hp-IgG抗体，操作步骤严格按试剂盒说明书方法进行。如果Hp-IgG浓度>20 U/mL为阳性，判定为Hp感染。

1.5 样本基因组 DNA 的提取严格按照DNA提取试剂盒试剂说明书提取基因组 DNA，将DNA产物保存于-20 ℃备用。

1.6 SNPs位点的选择通过查询HapMap国际人类基因组数据库和dbSNP数据库，以及查询SEMA5A基因多态性相关文献的基础上，共获取了该基因30个多态性位点，通过单核苷酸多态性选择的一般原则，筛选了能够代表SEMA5A基因大部分SNPs的6个标签SNPs(rs693487、rs6896702、rs788469、rs805153、rs1024489、rs2696371)。

1.7 TaqMan探针法进行基因分型

1.7.1 TaqMan探针的设计与合成根据NCBI网站上的SEMA5A基因相关信息，使用引物探针设计软件Primer Premier v6.0，设计TaqMan-MGB的探针和引物，引物序列信息见表1。

表1 设计和合成的TaqMan探针及引物序列

1.7.2 PCR(polymerase chain reaction)检测分型反应体系：DNA模板1.0 μL，PCR Premix Taq(2x)5.0 μL，上、下游引物(上海生工生物工程技术公司合成)及MGB探针各0.2 μL，最后用双蒸水补足至总反应体积为10.0 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 mim，95 ℃ 变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。为了质量控制，随机抽取5%的样品进行检测，分型符合率达到100%，以确保检测结果的准确性。

1.8 SNaPshot法进行基因分型为了验证TaqMan-MGB探针SNP基因分型方法的准确性，我们随机抽取两组各100个样本，使用SNaPshot方法对SEMA5A基因进行了基因分型。

1.8.1 引物设计合成根据SNaPshot引物设计原理设计了用于单碱基延伸的6条紧邻各个SNP位点的延伸引物。见表2、表3。

表2 PCR扩增引物序列

表3 PCR延伸引物序列

1.8.2 PCR检测分析PCR反应总体积为15 μL：模板DNA 1.0 μL，上下游引物各0.15 μL,10×Taq Plus Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Taq Plus DNA聚合酶0.25 μL，加入 ddH2O补足至15 μL。反应条件：预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s, 30个循环后，最后72 ℃延伸3 min，扩增产物经电泳提纯后放入PCR扩增仪，进行延伸反应。延伸后产物于3730XL基因测序仪测序。

1.9 统计学分析采用SPSS Statistics软件进行统计分析。用t检验比较胃癌组和对照组的年龄。采用χ2检验检测胃癌组与对照组之间吸烟状况、饮酒史和Hp感染之间存在的差异。用卡方检验分析胃癌组和对照组的多态性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用logistic回归分析计算OR和95% CI，根据年龄、性别、吸烟状况、饮酒史和Hp感染进行了调整，对其进行分层。以P≤0.05为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料比较胃癌组及健康对照组的性别、年龄、饮酒、吸烟等方面差异均无统计学意义(P>0.05)，胃癌组的Hp感染率与对照组相比明显偏高(P=0.023)，见表4。

表4 胃癌组和对照组间的一般特征

2.2 各基因型在胃癌组及对照组中的分布及与胃癌发生关系

2.2.1 Hardy-Weinberg 平衡定律检验经检验SEMA5A基因的6个SNP位点各组基因型统计结果均P>0.05，则认定6个SNP位点胃癌组和对照组的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，研究对象来自于同一人群。

2.2.2 各位点基因多态性分布分析rs805153位点的3种基因型在胃癌组与对照组分布有显著差异，具有统计学意义(P=0.01)。TT基因型在经年龄、性别、Hp感染调整后OR值为2.74(95%CI:0.35-3.83,P<0.01)。而在隐性模型中，与CC基因型相比，TT+TC基因型也与患癌风险有关(P<0.01，OR=2.40，95% CI:1.28-2.96)。而rs693487、 rs6896702、rs788469、rs1024489、rs2696371这5个SNP位点的基因型在2组间分布均差异无统计意义(P>0.05)，见表5。

表5 SEMA5A基因多态性与胃癌风险的关系[n(%)]

2.2.3 rs805153位点的分层分析rs805153位点进一步分层进行logistic回归分析显示：TT+TC基因型与CC基因型相比，与男性胃癌的发病风险相关，经多因素校正后OR值为1.33(95%CI:0.81-2.23)。而在感染Hp时，TT+TC基因型也与胃癌的风险有关，经多因素调整后OR值为1.97(95%CI: 0.28-1.40)。其余因素年龄、吸烟史、饮酒史与胃癌发生风险无关联。见表6。

表6 胃癌组与对照组SEMA5A rs805153多态性及Logistic回归分析

3 讨 论

SEMA5A属于神经轴突导向分子SEMAs家族成员之一，位于人染色体5p15.2，全长51.8 kb，可作为血管生成，转移过程中细胞迁移和癌细胞器官特异性归巢所必需的分子[10]。多项研究表明，SEMA5A作为一种胃癌相关基因，在胃癌细胞中高表达并且可以上调癌细胞的增殖和转移生物学活性[6]。Hp感染可引起一系列癌前病变，是已知胃癌最大的危险因素。大量国内外研究证明，发生胃癌的风险取决于Hp菌株特异性毒力因子、宿主基因型、环境因素(如饮食)以及免疫反应等，这些因素之间相互作用将影响Hp长期定植的结果[11-12]。我组进一步研究发现SEMA5A在Hp阳性的胃癌组织中表达明显高于Hp阴性的胃癌组织，且Hp感染后在不同分子水平可以上调胃癌细胞株SEMA5A的表达，并且存在剂量-时间依赖性[13]，这表明SEMA5A可能参与Hp相关性胃癌。据统计，有20%的胃癌患者有胃癌家族史，根据种族或族裔群体，有胃癌家族史胃癌发生的风险增加了2～3倍[14]，这表明有胃癌家族史是一个重要的胃癌危险因素。胃癌病例有家族性聚集现象，这也说明了遗传多态性的重要性。

我们通过对SEMA5A基因6个SNP位点的基因型进行检测，分析了Hp感染与SEMA5A基因多态性在胃癌发生过程中的交互作用。SEMA5A基因存在较多的多态性位点，多项临床研究已证实SEMA5A基因的多态性位点与多种神经疾病有关，如rs7702187与帕金森病、rs194085与自闭症等[15-17]。全基因组关联分析也发现人染色体上SEMA5A附近的基因间SNP与自闭症谱系障碍显著关联。我们的研究结果显示SEMA5A基因的rs693487、rs2696371 SNP位点与胃癌发生及Hp感染无关联；SEMA5A基因的rs6896702、rs788469、rs1024489 SNP位点虽与胃癌发生及Hp感染无关系，但在性别方面与胃癌风险相关；SEMA5A基因rs805153位点与胃癌发生风险及Hp感染相关，TT基因型明显增加患胃癌风险，且与Hp感染关联。近年来，在对Hp相关性胃癌分子水平多态性研究更是热点，Jia等[18]发现Hp感染与基因多态性在胃癌发生中的相互作用，Hp感染增加了遗传基因易感性，导致DNA损伤和基因异常甲基化促进胃癌发生。Hong等[19]认为携带IL-1β基因多态性的人群在Hp感染后更易发生胃癌。研究报道遗传基因多态性与Hp感染发生交互作用致胃癌的过程中，依据Hp感染的状态不同胃癌易感性有所不同[20-22]。这些研究都表明胃癌发生过程中存在基因-环境交互作用模式。然而，关于SEMA5A基因多态性与胃癌间关系的还未见相关文献报道。本研究存在一些不足：首先，样本量相对较小，这可能会限制统计效果，尤其是在多重分层分析；其次，一些潜在的因素，如饮食、体育锻炼和胃病史，未纳入本研究的分析，这可能影响胃癌的发生风险；最后，仅对其在癌症发生中的潜在功能作用的进行推测，但缺少功能验证。本研究结论需要大量的实验研究来验证。

综上所述，SEMA5Ars805153位点与Hp感染以及胃癌发生风险具有相关性，且在男性人群较为显著，这为胃癌高危人群的发现、胃癌的预防和早期诊断提供候选分子，为进一步研究胃癌发生机制提供新的理论依据。