季 吉，陈 光，李丽丽，袁久刚，苑 超，王 平，许 波

(江南大学生态纺织教育部重点实验室，无锡 214122)

近年来多孔材料因其密度低、孔隙率高、比表面积高及重量轻等特点在组织工程、生物医药等领域得到广泛的研究和应用[1-4]。但目前大多数多孔材料以人工合成材料为主，如金属材料、无机质多孔材料等，其生物相容性有所欠缺。而生物相容性对多孔材料的应用具有重要影响。

为解决这一问题，研究者将目光投向了蛋白质类高分子材料。以丝蛋白、胶原蛋白以及角蛋白为代表的天然蛋白高分子不但来源丰富，而且具有生物相容性好及可生物降解等优点。在这3种蛋白质中，角蛋白来源最为丰富，而且在其一级结构中含有独特的RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)氨基酸序列[5-6]，这赋予了其更好的生物相容性。但是角蛋白分子间存在特殊的二硫键结构，其溶解和提取非常困难[7-9]。此外，角蛋白再生材料力学性能较差，存在着脆性强、弹性差、强力低等缺点，与天然角蛋白的优良性能完全无法比拟。为提升角蛋白多孔材料的力学性能，研究者通常采用的手段有物理共混[10-11]、化学改性[12-13]及改变成孔方法[14]等。近年来，为了进一步拓宽蛋白质生物材料或医药领域的应用，不少研究者还对多孔材料进行仿生矿化处理，即通过模拟体液法、交替矿化法或过饱和钙化溶液浸泡法等[15]，在材料表面形成羟基磷灰石(HAP)。HAP是自然界中天然存在的矿物质，具有良好的生物相容性和生物活性，在药物缓释[16]、基因传递[17]、组织工程[18]等领域均有应用。

本文在前期研究基础上，利用巯基-烯点击反应制备了聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)改性角蛋白，再与海藻酸钠(SA)共混，利用冷冻干燥法制备了多孔材料。最后，利用交替浸泡法在材料表面沉积HAP，实现了角蛋白多孔材料的仿生矿化，以期改善角蛋白多孔材料的力学性能，同时更好地保护其生物相容性。详细研究了角蛋白改性后所制备的多孔材料的力学性能、表面形貌、生物相容性、金属离子吸附能力等，这对探索其在生物医药、环境保护领域的应用前景具有较好的启示意义。

1 材料与方法

1.1 角蛋白的溶解和提取

将脱脂羊毛剪碎后，加入到尿素-氯化胆碱低共熔体系中，添加一定量的还原剂TCEP后，在125 ℃、N2保护下磁力搅拌5 h来溶解和提取羊毛角蛋白。完全溶解后，将上述角蛋白溶液在去离子水中透析3 d，最后用30%PEG20000溶液浓缩至一定浓度。

1.2 角蛋白多孔材料的制备

将浓缩至50 g/L的角蛋白溶液先于-20 ℃下冷冻24 h，然后于-50 ℃下冷冻干燥48 h，得到纯角蛋白多孔材料，再用乙醇醇化，最终得到纯角蛋白多孔材料(KR)。

对照样PEGDMA/SA多孔材料制备方法与纯角蛋白多孔材料制备方法一致，其溶液由去离子水、2.5%PEGDMA和一定量40 g/L的SA组成。

角蛋白与PEGDMA以及SA的混合物多孔材料(KR/PEGDMA/SA)制备方法与纯角蛋白多孔材料制备方法一致，其溶液由50 g/L的角蛋白溶液、2.5%PEGDMA和一定量40 g/L的SA组成。

PEGDMA改性角蛋白与SA的混合物多孔材料(PEG-g-KR/SA)制备方法与纯角蛋白多孔材料制备方法一致，其溶液由50 g/L的角蛋白溶液、2.5%PEGDMA、1%的环偶氮脒类引发剂以及一定量40 g/L的SA组成。

1.3 角蛋白多孔材料的矿化

采用交替矿化法对角蛋白多孔材料表面进行矿化。分别将KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA浸泡于37 ℃的CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2浓度为500 mmol/L；Tris-HCl浓度为50 mmol/L，pH值为7.5)中30 min，用去离子水冲洗后，再浸泡于37 ℃的Na2HPO4/Tris-HCl溶液(Na2HPO4浓度为300 mmol/L；Tris-HCl浓度为50 mmol/L，pH值为8.5)中30 min，最后用去离子水冲洗。上述步骤为一个周期，重复5个周期后冷冻干燥。

1.4 红外测试

采用Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)对样品进行红外光谱分析，扫描范围为4 000～500 cm-1，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。

1.5 物相分析

使用D8型X射线衍射仪(德国布鲁克AXS有限公司)对样品进行测定，测试条件为：CuKα靶(λ=0.154 nm)，电压40 kV，电流30 mA，步长0.05°，扫描速度2°/min，扫描范围5°～40°。

1.6 表面形貌观察

将多孔材料样品喷金后，采用Hitachi SU1510扫描电子显微镜(日本HITACHI公司)观察表面形貌，放大倍数为100和5 000倍。

1.7 力学性能测试

采用MIT-1万能测试仪(江苏省常州市三丰仪器科技有限公司)对样品进行压缩性能测试，压缩速率为0.5 mm/min。

1.8 生物相容性测试

采用MTT法对样品进行体外细胞毒性测试。先将500 μL 3T3细胞悬液加入到有样品的孔板中(细胞接种密度约5×103个/孔)，空白对照组仅加入细胞而不加样品。将接种了细胞的培养板放入细胞培养箱中培养48 h后，向含有细胞的孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续在37 ℃细胞培养箱中孵育4 h，随后吸掉MTT溶液，再加入100 μL DMSO显色。最后，使用Multiskan FC酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定450 nm波长下不同细胞培养板里每孔的吸光度值，每个样品进行5组平行试验。按如下公式计算细胞的存活率：

细胞存活率=A1/A0×100%

其中：A1为实验组样品的吸光度；A0为空白对照样品的吸光度。

1.9 Cu2+吸附测试

将样品分别加入到初始质量浓度为900 mg/L、pH 5.5的Cu2+溶液中，在25 ℃、150 r/min的恒温振荡器中振荡一定时间后，取上层清液，加入稍过量的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，形成蓝色的EDTA-Cu络合物，利用UV-1800紫外分光光度计(日本SHIMADZU公司)在735 nm处进行吸光度测试。

2 结果与讨论

2.1 多孔材料的产品外观

通过冷冻干燥法制备的多孔材料外观完整，呈圆柱形。纯角蛋白多孔材料(KR)表面有许多大而不规则的孔隙，其质地非常脆且易碎；对照样PEGDMA/SA多孔材料的弹性较好，但是强力较低，在外界压力下很容易变形。KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA两种多孔材料的孔隙都小而密，其硬度和弹性均有所提升；经过仿生矿化，KR/PEGDMA/SA/5 cycles和PEG-g-KR/SA/5 cycles表面均匀地沉积了HAP晶体，材料的整体强度进一步提升。多孔材料中的外观形貌见图1。

图1 多孔材料的外观形貌

2.2 角蛋白多孔材料性质分析

2.2.1 红外测试

图2 角蛋白多孔材料的红外谱图

2.2.2 XRD分析

在KR的XRD谱图(图3)中，2θ=10°和2θ=20°左右的特征峰分别代表了角蛋白的α-螺旋和β-折叠结构，其衍射峰非常明显；与PEGDMA共混或接枝后，2θ=10°附近的衍射峰明显减小，表明α-螺旋含量减少，这是由于分子间氢键作用力的增强，破坏了角蛋白α-螺旋的有序结构。

图3 角蛋白多孔材料的XRD图

经过矿化，角蛋白的α-螺旋和β-折叠特征峰几乎消失，KR/PEGDMA/SA/5 cycles和PEG-g-KR/SA/5 cycles都在2θ=26.3°(晶面002)和2θ=31.8°(211)处有明显的HAP衍射峰[21]，并且，PEG-g-KR/SA/5 cycles在2θ=32.9°(300)，2θ=34.1°(202)和2θ=39.4°(310)处的衍射峰面积更大，测试结果与纯HAP的XRD数据相符，由此可以推测，矿化后PEG-g-KR/SA表面生成了更多的HAP。

2.2.3 表面形貌观察

纯角蛋白多孔材料[图4(a1)和(b1)]的表面非常光滑、平整，PEG-g-KR/SA表面则可以观察到孔状结构，说明与PEG接枝后角蛋白有更好的成孔能力。矿化后，多孔材料表面变得粗糙，有颗粒状无机物生成，表明HAP成功沉积于角蛋白多孔材料表面。PEG-g-KR/SA/5 cycles表面生成的颗粒物体积比KR/PEGDMA/SA/5 cycles表面的更小、更多，且分布更为均匀[图4(a2)和(b2)]，这是因为PEG-g-KR/SA的比表面积更大，沉积位点更多，有利于HAP沉积。

图4 角蛋白多孔材料的表面形貌(100倍、5 000倍)

2.2.4 力学性能测试

纯角蛋白多孔材料(KR)表现出很强的脆性，当应变达到16%时，材料就已经完全破碎。对照物PEGDMA/SA多孔材料的应力-应变曲线几乎为一条直线，说明不含角蛋白的多孔材料没有刚性。KR/PEGDMA/SA的屈服点应力为0.57 MPa，且表现为塑性，在其应力-应变曲线上有一段屈服平台，屈服平台越长，材料抗破坏的能力越强。PEG-g-KR/SA则表现为典型的弹性材料，其屈服点应力为1.2 MPa，说明与PEG接枝制备的角蛋白多孔材料既有良好的弹性又有一定的刚性。见图5。

图5 角蛋白多孔材料的应力应变曲线

经过矿化，KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA的屈服点应力分别增大至2.7 MPa和3.1 MPa，并且仍然分别表现为塑性和弹性材料。仿生矿化在保持角蛋白多孔材料原本性能的同时，进一步提升了多孔材料的力学性能。

2.2.5 生物相容性测试

纯角蛋白(KR)上细胞存活率约为96.2%，大于PEGDMA/SA上的94.53%，PEG-g-KR/SA多孔材料的细胞存活率(117.78%)大于KR/PEGDMA/SA多孔材料(100.44%)，矿化后细胞存活率则进一步提升。这说明角蛋白有助于提升多孔材料的生物相容性，与PEG接枝后的角蛋白多孔材料无细胞毒性，且生物相容性大大提升。矿化后的角蛋白多孔材料的细胞存活率略高于矿化前，可见多孔材料表面沉积的HAP有利于细胞的附着与增殖。见图6。

* 为P<0.05。

2.2.6 Cu2+吸附测试

角蛋白多孔材料对Cu2+具有较强的吸附能力，其吸附量随时间增加而上升(图7)。前6 h内，PEG-g-KR/SA/5 cycles吸附速率最快，KR/PEGDMA/SA吸附速率最慢；吸附10 h后，吸附速率达到平衡，其24 h的吸附量分别为142.4 mg/g(KR/PEGDMA/SA)、155.6 mg/g(KR/PEGDMA/SA/5 cycles)、147.1 mg/g(PEG-g-KR/SA)和159.0 mg/g(PEG-g-KR/SA/5 cycles)。该结果表明，PEG改性角蛋白多孔材料对Cu2+的吸附能力强于物理共混的角蛋白多孔材料，经过矿化后，角蛋白多孔材料对Cu2+的吸附能力进一步提高。这是由于接枝制备的多孔材料中角蛋白与PEGDMA、SA的排列更紧密有序，有更多稳定的羧基、羟基结构可以与铜离子络合。而矿化后，在材料表面沉积的HAP中含有易和金属离子发生置换的Ca2+，因此可以吸附更多的Cu2+。

(a)Cu2+标准曲线;(b)24 h吸附曲线。

3 结论

通过巯基-烯点击化学反应制备的PEG改性角蛋白多孔材料具有良好的弹性和刚性，其力学性能、生物相容性均比纯角蛋白多孔材料优异。经过仿生矿化，多孔材料表面生成了体积更小、分布更均匀的HAP，这进一步提升了角蛋白多孔材料的力学性能和生物相容性。而且本文制备的多孔材料对Cu2+有较好的吸附作用，其24 h吸附量高达159.0 mg/g。这对扩展角蛋白多孔材料的应用具有较好的启示意义。