王 静，袁 渊，周 敏，李 妘

(1.陕西省肿瘤医院妇瘤科,陕西 西安 710061；2.汉中市中心医院妇科,陕西 汉中 723000)

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，也是病死率居第二位的妇科肿瘤[1]。尽管早期宫颈癌患者行手术或放疗等局部治疗手段可取得良好疗效，但是中晚期宫颈癌患者多死于肿瘤侵袭及转移，导致预后不良[2]。已有研究[3]显示无淋巴结转移的早期宫颈癌患者的5年生存率在85%以上，而伴淋巴结转移的相同临床分期的患者5年生存率低于50%。因此，研究宫颈癌的早期诊断以促进改善患者的预后一直是我国妇科肿瘤学的重点。细胞周期蛋白依赖性激酶亚基(Cyclin-dependent kinase subunit，CKS)蛋白家族大量存在于哺乳动物细胞中，CKS2为CKS蛋白家族的重要一员，由79个氨基酸构成，具有81%的同源性[4-5]。人体CKS2基因位于人类染色体9q22上，具有促进肿瘤增殖的作用[6]。有研究[7]表明CKS2与多种恶性肿瘤的临床分期、淋巴结转移与组织学分化存在相关性，可在多种恶性肿瘤中CKS2通过正向调控细胞周期、侵袭和转移来促进肿瘤的进展，但是具体的作用机制还不明确。线粒体通过自身融合、分裂可影响自身的形态与功能，从而参与调节细胞的生物学行为。比如线粒体的分裂不仅可以生成新的线粒体，还可以在数秒内改变位置、形态与大小，还可以通过清除功能异常与损伤的线粒体以保证其正常的生理功能[8]。线粒体整合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)是反应机体线粒体功能的重要蛋白，与线粒体的分裂和融合密切相关，也是一种定位在线粒体外膜的具有GTP酶活性的蛋白[9-10]。本文探讨了CKS2蛋白通过干预线粒体功能促进宫颈癌细胞增殖的机制，希望为明确CKS2蛋白的作用效应提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SiHa细胞购置于上海中科院(在10%胎牛血清的DEME培养基内,37 ℃、5% CO2孵箱中培养，培养2～3 d后进行传代,取生长状态好、对数生长期的细胞用于实验),转染试剂盒购自美国Sigma公司，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自上海碧云天生物技术有限公司,MTT检测试剂盒购自上海生工公司。丙烯酰胺购自北京索莱宝生物工程有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购自美国Hyclone公司，β-actin 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，细胞消化酶、双抗购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞瞬时转染：对数生长期的SiHa细胞设三组：空白对照组(不进行转染)、阴性对照组(转染Hs-NC siRNA)与CKS2 siRNA组(转染Hs-CKS2 siRNA)。0.25%胰酶消化90%生长密度的SiHa细胞，800 r/min 离心5 min后进行悬浮，然后接种到96孔板。培养24 h后进行Hiperfect Transfection Reagent转染，严格按照试剂盒进行操作，转染4～6 h后吸弃96孔板培养液，然后进行常规培养。

1.2.2 MTT检测细胞增殖活性：转染后制备出细胞悬液，按照每个孔细胞数为5×103个进行接种到96孔板。培养24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培育4 h。吸弃孔内培养液，添加 DMSO，然后执行10 min的振荡操作，使得结晶溶解充分，利用酶标仪检测对490 nm波长位置进行检测，计算细胞增殖指数。

1.2.3 Transwell检测细胞侵袭及转移：转染后制备出细胞悬液，取200 μl细胞悬液加入到Transwell小室，在Transwell小室的下室加入500 μl含血清的DMEM培养基。培养24 h后取出小室后进行细胞固定，结晶紫染色后进行倒置镜下观察，记录与计算细胞侵袭及转移指数。

1.2.4 线粒体膜电位检测：转染后制备出细胞悬液，加入1×JC-1染色工作液混匀，避光孵育30 min。然后再用1×JC-1染色缓冲液洗涤2次(每次5 min左右)，再加入1×JC-1染色缓冲液重悬细胞，用线粒体膜电位检测试剂盒检测，用平均荧光强度表示线粒体膜电位变化。

1.2.5 qPCR检测CKS2与Mfn2 mRNA表达水平：转染后提取细胞总RNA，取1 ng RNA进行反转录反应得到cDNA，采用qPCR方法检测CKS2与Mfn2 mRNA表达水平，CKS2上游引物5’-ACGTTAACCGGAAACCTTATGGCCG-3’，下游引物5’-GGTCCCGGGCCTTTGTCATTT-3’。Mfn2：上游引物5’-GAATGAAACCTTAGCTGCAAGCA-3’，下游引物5’-CACAGTGGCTTTGACCCCAGCCGAACAA-3’。

1.2.6 Western blot法检测Mfn2、CKS2蛋白表达水平：转染后提取细胞总蛋白，沸水浴变性5 min，蛋白上样选用50 μg，通过SDS-PAGE实现分离，对蛋白进行点转移，转到硝酸纤维素膜之上， 5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗(抗Mfn2抗体、抗β-actin抗体、抗CKS2抗体)4 ℃培养过夜，TBST洗膜，二抗室温培养1 h，TBST洗膜，采用增强型化学发光(ECL)试剂盒进行曝光处理，以β-actin 作为内参计算相对表达量。上述所有实验都采用3复孔计算，记录平均值。

2 结 果

2.1 三组细胞增殖指数对比 转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的细胞增殖指数低于阴性对照组、空白对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 三组细胞增殖指数对比(%)

2.2 三组细胞侵袭及转移指数对比 转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的细胞侵袭及转移指数低于阴性对照组、空白对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 三组细胞侵袭及转移指数对比(%)

2.3 三组线粒体膜电位水平对比 转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的细胞线粒体膜电位水平高于阴性对照组、空白对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 三组线粒体膜电位水平对比(平均荧光强度)

2.4 三组CKS2与Mfn2 mRNA相对表达水平对比 转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的CKS2与Mfn2 mRNA相对表达水平低于阴性对照组、空白对照组(均P<0.05)，见表4。

表4 三组CKS2与Mfn2 mRNA相对表达水平对比

2.5 三组CKS2与Mfn2蛋白相对表达水平对比 转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的CKS2与Mfn2蛋白相对表达水平低于阴性对照组、空白对照组(均P<0.05)，见表5。

表5 三组CKS2与Mfn2蛋白相对表达水平对比

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖器常见肿瘤之一，虽然当前医学技术有所提高，但是宫颈癌的5年生存率有待提高。对于晚期有远处转移的宫颈癌患者，失去了手术治愈的机会，传统放疗与化疗的效果也不佳，在临床上多采用对症性支持治疗或姑息性治疗，寻找靶向治疗方法也具有重要的意义[11]。有研究显示宫颈癌的CKS2蛋白表达水平与患者的病理特征、预后存在相关性，CKS2可通过影响p27蛋白泛素化降解来发挥作用，还可参与调节细胞的凋亡过程[12]。本研究显示转染后24 h与36 h，CKS2 siRNA组的细胞增殖指数、细胞侵袭及转移指数低于空白对照组、阴性对照组,表明抑制CKS2的表达可抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭与转移。从机制上分析，抑制CKS2的表达可使得肿瘤细胞的增殖速度减慢，细胞平均凋亡率增加，细胞S期比率增加，从而发挥抑癌作用[13]。还有研究表明CKS2蛋白可参与调节乳腺癌细胞的凋亡状况，也可通过保护内分泌组织癌变、细胞免受程序性死亡来调节细胞凋亡[14]。

宫颈癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期发病比较隐匿，导致很多患者无法在早期进行手术治疗，需要寻找其他治疗方法。现代研究表明肿瘤在发生与发展过程中包含了许多治疗靶点，针对某些治疗靶点进行针对性治疗可能成为治愈宫颈癌的有效方法和途径之一。线粒体可通过分裂和融合不断地影响着线粒体的形态，Mfn2位于线粒体膜外，可通过参与线粒体的形态的调节来维持线粒体网络功能的运行，也被证实是细胞增殖及凋亡信号转导通路中的重要调控点[15]。Mfn2可以减弱线粒体膜的稳定性，促使线粒体通透性孔隙开放，使线粒体外膜生成孔隙。抑制Mfn2的表达可维持线粒体片段化，抑制线粒体的融合，从而对细胞凋亡发挥重要的调节作用。本研究显示转染后24、36 h，CKS2 siRNA组的细胞线粒体膜电位水平高于空白对照组、阴性对照组,表明抑制CKS2的表达可提高细胞线粒体膜电位水平。线粒体膜电位的改变是线粒体参与内源性凋亡途径中的重要信号，也是细胞增殖转导通路中的一个重要调控点。有研究表明CKS2具有促进肿瘤细胞增殖的作用，可通过影响p27蛋白泛素化降解来发挥作用，还可以对线粒体外膜通透进行调节，影响肿瘤细胞的凋亡功能[16]。

Mfn2为一种增殖基因，当前被认为是治疗肿瘤等疾病的靶点。从生物结构上分析，Mfn2包含有GTP结合位点、跨膜区、PKA/PKG磷酸化位点、P21Ras结构域等。Mfn2可抑制血管平滑肌细胞增殖，使其停滞于G0/G1期[17]。Mfn2定位于线粒体外膜，参与了线粒体形态的调节，还可以调节线粒体膜的稳定性，促使线粒体通透性孔隙开放[18-19]。Mfn2还可与促凋亡分子Bax共定位于线粒体，从而影响Bax蛋白的表达[20]。本研究显示转染后24 h与36 h，CKS2 siRNA组的CKS2与Mfn2 mRNA、蛋白相对表达水平低于空白对照组、阴性对照组,表明抑制CKS2的表达可抑制宫颈癌细胞Mfn2的表达。

总之，抑制CKS2的表达可通过干预线粒体膜电位水平，抑制宫颈癌细胞Mfn2的表达，从而抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭与转移。