刘世军，帕合热叶·卡哈尔，张 娱

陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育）/陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083

大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实［1］。具有补中益气、养血安神、缓和药性等功效［2］。现代药理学研究表明，大枣具有抑制肿瘤、抗氧化、保肝、抗过敏、增强肌力、镇静、抗压、抗衰老等作用［3-5］。大枣中所含的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）活性成分有抑菌保肝、抗心律失常、降低血糖和血清胆固醇［5］等作用。

现代研究表明，大枣含有多种有效成分。例如，大枣果实含有生物碱：光千金藤碱、吡咯烷生物碱、巴婆碱；三萜酸类：白桦酯酸、齐墩果酸、马斯里酸（山楂酸）；皂苷类：大枣皂苷、酸枣皂苷；黄酮类：芸香苷（芦丁）；脂肪酸：油酸［6］等。2015 版《中华人民共和国药典》以齐墩果酸、白桦酯酸为对照控制大枣质量。大枣因产地、生长环境和采摘条件的不同，其化学成分会发生一定变化。本试验采用薄层色谱法（TLC）对大枣中的三萜类成分白桦酯酸、齐墩果酸和其他成分进行色谱分析，探索大枣的炮制原理。

1 材料

1.1 仪器C21-HT2109 型多功能电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）；WF-H201B 紫外透射反射仪（上海精科实业有限公司）；KQ3-00DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公祠）；100×100 双槽层析缸、硅胶G 薄层板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）。

1.2 材料大枣（新疆大枣，产地新疆托克逊），白桦酯酸（陕西乐博生化科技有限公司，批号：16072201），齐墩果酸（陕西乐博生化科技有限公司，批号：16051205），石油醚（60～90℃，天津市天力化学试剂有限公司），甲苯（洛阳昊华化学试剂有限公司），乙酸乙酯（天津市天力化学试剂有限公司），冰醋酸（天津市天力化学试剂有限公司），甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），三氯甲烷（成都市科隆化学品有限公司），丙酮（成都市科隆化学品有限公司）。

2 方法与结果

2.1 大枣炮制品的制备按《中药大辞典》［6］中大枣的炮制方法，自制不同时间下大枣的清蒸炮制品。取大枣洗净，置蒸笼内，加热蒸制，取出干燥。见表1。

表1 大枣样品炮制方法与性状观察

2.2 对照品溶液的制备精密称取白桦酯酸0.0100g，齐墩果酸0.0100 g，各加乙醇10 mL，超声处理30 min制成1 mL含1 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 供试品1 的制备 取大枣生品1.0134 g，清蒸（15 min）1.0186 g，清蒸（30 min）1.0055 g，清蒸（45 min）1.0113 g，清蒸（60 min）1.0734 g，各加石油醚10 mL，浸泡10 min，超声处理15 min，滤过，药渣加无水乙醚10 mL，浸泡1 h，超声处理15 min，滤液浓缩至1 mL。

2.3.2 供试品2 的制备 取大枣生品1.0659 g，清蒸（15 min）1.0754 g，清蒸（30 min）1.0401 g，清蒸（45 min）1.0128 g，清蒸（60 min）1.0661 g，各加水20 mL，超声处理15 min，加盐酸0.7 mL，加热水解1 h，滤过，滤液浓缩至10 mL，用乙酸乙酯振摇提取两次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解。

2.3.3 供试品3 的制备 取大枣生品2.0162 g，清蒸（15 min）2.0148 g，清蒸（30 min）2.0158 g，清蒸（45 min）2.0163 g，清蒸（60 min）2.0129 g，各加甲醇20 mL，浸泡10 min，超声处理15 min，滤过，滤液浓缩至2 mL。

2.4 预试验

2.4.1 供试品1 分别吸取供试品1溶液10 μL，对照品溶液各4 μL，点于薄层板上，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸，分别按a（14∶3∶0.5）、b（16∶4∶0.5）、c（16∶5∶0.5）3 种比例展开，观察斑点。见图1。

图1 供试品1的薄层色谱图

2.4.2 供试品2 分别吸取供试品2溶液10 μL，分别点于薄层板上，展开剂为三氯甲烷：丙酮，分别按a（8∶0.5）；b（4∶1）；c（10∶0.5）3 种比例展开，观察斑点。见图2。

图2 供试品2的薄层色谱图

2.4.3 供试品3 分别吸取供试品3溶液10 μL，对照品溶液4 μL 分别点于薄层板上、展开剂为石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸，分别按a（4∶0.5∶3滴）、b（4∶1∶0.5）、c（5∶1∶3 滴）3 种比例展开，观察斑点。见图3。

图3 供试品3的薄层色谱图

2.5 供试品的薄层层析

2.5.1 供试品1 吸取供试品1 约10 μL 点样，在薄层板上依次点1 生品、2 清蒸大枣（15 min）、3清蒸大枣（30 min）、4 清蒸大枣（45 min）、5 清蒸大枣（60 min）、6 齐墩果酸、7 白桦酯酸对照品溶液，以甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸（16∶5∶0.5）为展开剂，展开完全后，用10% 硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，在日照和紫外光365 nm 下观察斑点。见图4。

图4 供试品1的薄层鉴别图谱

由图4可以看出，供试品1在日照下图谱中共有8个清晰且分离度较好的斑点；在紫外光365 nm下共有8 个清晰的斑点；图4 中可以确定e、f 两个化合物分别为齐墩果酸、白桦酯酸。

日照下图谱：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的a、b两点较深，e、g、h 4个点较淡；3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g、h 7 个点较深，a 点较淡；4（清蒸45 min）的b、c、d、g、h 5 个点较深；5（清蒸60 min）的b、c、d、f、g、h 6个点较深。不同时间清蒸大枣比较，3（清蒸30 min）的b、c、d、e、f、g 6个点最深。

紫外光365 nm：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的g、h 两个点较深，b 点较淡；3（清蒸30 min）的g点较深，d、e两个点较淡；4（清蒸45 min）的c、e、g、h 4个点较深；5（清蒸60 min）的c、d、e、f、g、h 6个点较深。不同时间清蒸大枣相比：5（清蒸60 min）的d、e、h3个点较深。

2.5.2 供试品2 吸取供试品2约10 μL点样，在薄层板上依次点1 生品、2 清蒸大枣（15 min）、3 清蒸大枣（30 min）、4 清蒸大枣（45 min）、5 清蒸大枣（60 min），以三氯甲烷∶丙酮（10∶0.5）为展开剂、展开完全后用10%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，在日照和紫外光365 nm 下观察斑点。见图5。

图5 供试品2的薄层鉴别图谱

由图5可以看出，供试品2在日照下图谱中共有6个清晰且分离度较好的斑点；在紫外光365 nm下图谱中共有5个清晰且分离度较好的斑点。

日照下图谱：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的a、b 2个点较深；3（清蒸30 min）的a、b、c、d、f 5个点较深；4（清蒸45 min）的b、e、f 3 个点较深；5（清蒸60 min）的b、f 2个点较深；a、c、e 3个点较淡。不同时间清蒸大枣相比：3（清蒸30 min）的a、b、c、d 4个点最深；4（清蒸45 min）的e、f 2个点最深。

紫外光365 nm：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的c、d 2个点比较深；3（清蒸30 min）的c、e 2个点较深；4（清蒸45 min）的c、e 2 个点较淡；5（清蒸60 min）的e 点较深。不同时间清蒸大枣比较，3（清蒸30 min）的c、e 2个点最深；4（清蒸45 min）的c、e 2个点最淡。

2.5.3 供试品3 吸取供试品3 约10 μL 进行点样，并在薄层板上点1生品、2清蒸大枣（15 min）、3 清蒸大枣（30 min）、4 清蒸大枣（45 min）、5 清蒸大枣（60 min）及齐墩果酸对照品溶液，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（4∶1∶0.5）为展开剂，展开完全后用10%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，在日照和紫外光365 nm下观察斑点。见图6。

图6 供试品3的薄层鉴别图谱

由图6可以看出：供试品3在日照下图谱中共有5 个清晰且分离度较好的斑点；在紫外光365 nm下共有5个清晰且分离度较好的斑点，图6中可以确定c为齐墩果酸。

日照下图谱：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的a、c 2个点较深；新出现了d、e 两个点；3（清蒸30 min）的a、c 2个点较深；4（清蒸45 min）的a 点较淡；5（清蒸60 min）的c点较深；a、b 2个点较淡。不同时间清蒸大枣相比：2（清蒸15 min）的a、c 2个点最深，出现了d、e两个新点。

紫外光365 nm：与大枣生品比较，2（清蒸15 min）的a、b、c 3个点较深，新出现了d、e 2个新点；3（清蒸30 min）的a、b、c 3个点较深；4（清蒸45 min）的c点较淡；5（清蒸60 min）的a、b、c 3个点较深。不同时间清蒸大枣比较2（清蒸15 min）的a、b、c 3个点最深；出现了d、e 2个新点。

3 结论

薄层色谱是一种分离速度快，应用广泛的色谱分析方法，其特点是可以同时分离多个样品，分析成本低［8-9］，是目前《中华人民共和国药典》中记载最多的鉴别与有关物质检查方法之一，用于药物中杂质的检查和药物分析［10］。本试验为设备、试验成本和技术要求高的学术研究提供了较大研究空间，节约了人力、物力和财力。

该试验用薄层色谱法鉴别大枣不同炮制时间有效成分的变化，并对不同炮制时间的大枣建立了薄层鉴别特征图谱。该图谱可以区分生大枣和清蒸大枣，也可以区分不同炮制时间下的清蒸大枣，而且根据图谱中斑点的颜色变化粗略判断大枣的炮制程度。供试品1和供试品2的薄层色谱鉴定结果与《中药大辞典》大枣清蒸30 min结果一致。

本试验采用不同提取方法，用薄层色谱对大枣的不同清蒸品有效成分的变化进行研究。预试验简便，能快速确定展开条件，但在试验过程中容易出现边缘效应，影响色谱效果，导致斑点分离度不好，拖尾。试验过程需要不断调节展开条件，保证预饱和，这样可以解决边缘效应以及斑点的分离度，预防拖尾。由于大枣对照品的缺失和得到困难，我们无法判断薄层色谱中每个点代表什么成分，但是我们可以判断大枣在炮制前后化学成分发生了一定变化，这可以为大枣的炮制以及其他中药材炮制原理的研究提供一定思路。由于每个人对颜色的感知不同，在观察点的深浅时会略有差异，今后我们会不断改进条件，或者采用一些先进设备，减少人为出现的误差。